大鼠胸主動(dòng)脈瘤血管發(fā)生及黏附分子變化的研究.pdf

1、目的:
　　 目前認(rèn)為,血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)降解、透壁炎癥反應(yīng)和血管發(fā)生增強(qiáng)是主動(dòng)脈瘤的典型的病理學(xué)特征。血管發(fā)生是指在原有血管的基礎(chǔ)上生成新血管的過(guò)程,這一過(guò)程在很大程度上受一系列刺激因子及抑制因子之間的相互作用來(lái)調(diào)控。通常情況下體內(nèi)血管處于靜息狀態(tài),組織微環(huán)境中抑制因子的影響占主導(dǎo)地位,所以不會(huì)有血管生成。當(dāng)組織發(fā)生損傷、炎癥時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等受局部微環(huán)境變化的刺激作用,合成和釋放促血管生成因子增加,使組織中原有調(diào)控血管

2、生成的平衡被打破,即發(fā)生血管生成過(guò)程。近年來(lái)的研究表明,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血小板反應(yīng)蛋白-1(ITSP-1)是目前較為重要的血管刺激因子和抑制因子。VEGF是目前文獻(xiàn)上公認(rèn)的最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子,通過(guò)它可以改變血管再生的一些重要過(guò)程。TSP-1能夠特異性地拮抗VEGF的功能,二者在生理性和病理性的血管生成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。因此,研究胸主動(dòng)脈瘤中血管生成的相關(guān)因子VEGF和TSP-1尤為重要。目前,二者在胸主動(dòng)脈瘤中的作用及

3、臨床意義的研究還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。
　　 血管發(fā)生過(guò)程中,來(lái)源于巨噬細(xì)胞的蛋白水解酶的活化和血管生成因子的影響,首先使血管基膜分解和局部細(xì)胞外基質(zhì)降解,血管通透性增大,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)新血管生成;炎癥的發(fā)生和巨噬細(xì)胞的聚集加速這個(gè)過(guò)程的發(fā)展。同時(shí),血管通透性的增加也促進(jìn)了炎性細(xì)胞的遷移。血管發(fā)生的程度和炎癥程度呈正相關(guān)。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)貫穿于腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)形成的

4、全過(guò)程,兩者呈正相關(guān)。細(xì)胞黏附分子是一類參與調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmarx,ECM)間相互結(jié)合、起黏附作用的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白。其中研究最多的是免疫球蛋白超家族成員中血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)。VCAM-1和ICAM-1在介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的粘附、滾動(dòng)及跨內(nèi)皮細(xì)胞表面向血管壁遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前的研究已經(jīng)證實(shí)正常飲食飼養(yǎng)的鼠動(dòng)脈壁罕有VCAM-1和IC

5、AM-1,而高脂飲食飼養(yǎng)4周的鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VCAM-1和ICAM-1增加。但高脂飲食是否會(huì)促進(jìn)胸主動(dòng)脈瘤的炎性細(xì)胞增加,是否會(huì)促進(jìn)VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)增加,尚不明確。
　　 另外,文獻(xiàn)報(bào)道目前“CaCl2誘導(dǎo)”方法是胸主動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型的首選理想方法,該方法已經(jīng)被國(guó)際所認(rèn)同。因此本研究采用CaCl2誘導(dǎo)方法制作大鼠胸主動(dòng)脈瘤模型,研究胸主動(dòng)脈瘤中血管生成的相關(guān)因子VEGF和TSP-1的表達(dá);同時(shí)探討在給予大鼠高脂

6、飲食后胸主動(dòng)脈瘤中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和粘附分子(VCAM-1和ICAM-1)的變化,為揭示胸主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、模型制作及分組
　　 將30只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為三組,即對(duì)照組、手術(shù)組和高脂飲食組,采用氯化鈣(CaCl2)誘導(dǎo)法制備胸主動(dòng)脈瘤模型,于術(shù)后4周取外敷段CaCl2(對(duì)照組取外敷生理鹽水段)胸主動(dòng)脈。
　　 2、Romies地衣紅染色和HE染色觀察

7、胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變
　　 分別選取各組大鼠用多聚甲醛固定的胸主動(dòng)脈組織,制作石蠟切片,分別進(jìn)行Romies地衣紅染色和HE染色,梯度脫水,中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察,攝片。
　　 3、CD45、VCAM-1、ICAM-1、VEGF和TSP-1的免疫組化
　　 分別選取各組大鼠多聚甲醛固定的胸主動(dòng)脈組織,制作石蠟切片,分別進(jìn)行胸主動(dòng)脈的CD45、VCAM-1、ICAM-1、VEGF和TSP-1免疫組織化學(xué)染色,D

8、AB顯色,中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察,攝片。
　　 4、VEGF和TSP-1的WesternBlotting檢測(cè)
　　 分別取新鮮胸主動(dòng)脈組織,經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,提取上清蛋白,電泳,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)封閉后分別加一抗4℃過(guò)夜;HRP標(biāo)IgG孵育2h,ECL發(fā)光,檢測(cè)各條帶光密度值。
　　 結(jié)果:
　　 1、大鼠術(shù)后狀態(tài)
　　 實(shí)驗(yàn)期間,大鼠毛色光潔,情緒良好;進(jìn)食量較穩(wěn)定,高脂飲食組和手術(shù)組

9、進(jìn)食量無(wú)顯著差異(P＞0.05),實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物體重增長(zhǎng)較平穩(wěn)無(wú)明顯差異,未見(jiàn)明顯異常特征,未發(fā)生自然死亡。
　　 2、Romies地衣紅染色和HE染色胸主動(dòng)脈大體變化
　　 應(yīng)用Romies地衣紅染色,可見(jiàn)不同組動(dòng)脈管徑和管壁彈力板的變化。高脂飲食組動(dòng)脈瘤管徑較手術(shù)組明顯擴(kuò)張,彈力板斷裂溶解、數(shù)目減少、間隙更大。HE染色見(jiàn)正常動(dòng)脈壁排列規(guī)則,動(dòng)脈瘤和高脂飲食組動(dòng)脈管壁的中膜變薄、管壁細(xì)胞數(shù)目減少。
　　 3、CD

10、45、VCAM-1、ICAM-1免疫組化的結(jié)果
　　 CD45、VCAM-1和ICAM-1在正常胸主動(dòng)脈內(nèi)膜呈少量表達(dá),高脂飲食組表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,較正常飲食組多;VEGF在手術(shù)組,多在中膜和外膜陽(yáng)性表達(dá),而在對(duì)照組中弱陽(yáng)性表達(dá)或不表達(dá);TSP-1在手術(shù)組,幾乎不表達(dá),而在對(duì)照組中多位于中膜和外膜。
　　 4、VEGF和TSP-1的結(jié)果
　　 動(dòng)脈瘤VEGF較正常胸主動(dòng)脈表達(dá)升高,TSP-1較正常胸主動(dòng)脈表達(dá)降低。<