骨髓間充質干細胞內源性IL-6調節(jié)OGD損傷星形膠質細胞的機制研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質干細胞分離共培養(yǎng)對OGD損傷星形膠質細胞的影響
　　目的：利用氧糖剝奪(OGD)損傷的星形膠質細胞與MSCs分離共培養(yǎng)模型，探討MSCs對OGD損傷星形膠質細胞的影響。
　　方法：原代大鼠培養(yǎng)星形膠質細胞，利用星形膠質細胞標志蛋白GFAP對其進行鑒定。建立星形膠質細胞OGD損傷模型，并與MSCs分離共培養(yǎng)，同時以未損傷星形膠質細胞（control組）和單獨OGD損傷組（OGD組）為對照。ELISA檢測共培養(yǎng)

2、上清中IL-6分泌情況，Real-time PCR和western blot分別檢測IL-6信號通路相關因子及Bcl-2、Bax凋亡相關因子的mRNA及蛋白表達變化。鈣影像系統(tǒng)檢測ATP刺激后不同處理組星形膠質細胞胞中Ca2+濃度，CCK-8試劑盒檢測星形膠質細胞的增殖狀況。
　　結果：
　?。?）經GFAP免疫熒光方法鑒定，原代培養(yǎng)的星形膠質細胞純度超過95％。
　　（2）ELISA檢測顯示MSCs分離共培養(yǎng)后的損傷

3、星形膠質細胞共培養(yǎng)液中IL-6的分泌水平明顯高于OGD組（P<0.05）。
　?。?）與MSCs分離共培養(yǎng)后，OGD損傷的星形膠質細胞中凋亡因子Bcl-2表達水平顯著升高（P＜0.01），Bax表達水平略有降低，但Bcl-2/Bax的表達水平比值卻明顯高于其他兩組（P＜0.05）。
　?。?）MSCs共培養(yǎng)誘導損傷星形膠質細胞中IL-6信號通路相關分子IL-6R和STAT3在mRNA和蛋白表達水平均呈現顯著上調。
　　

4、（5）與control組相比，ATP刺激可誘導OGD損傷的星形膠質細胞胞內Ca2+水平瞬間升高（P＜0.001），而MSCs分離共培養(yǎng)可顯著降低OGD損傷細胞內Ca2+水平（P＜0.05）。
　?。?）OGD損傷后星形膠質細胞增殖加速，而MSCs分離共培養(yǎng)可抑制損傷的星形膠質細胞增殖能力。
　　結論：OGD損傷導致星形膠質細胞Bcl-2/Bax表達水平比值下降，胞內Ca2+濃度增加，細胞增殖能力上調；而MSCs分離共培養(yǎng)上調

5、共培養(yǎng)上清中IL-6分泌水平，激活OGD損傷星形膠質細胞中IL-6R/STAT3信號通路，提高Bcl-2/Bax的比值，降低損傷細胞胞內Ca2+釋放，抑制損傷星形膠質細胞增殖。
　　第二部分骨髓間充質干細胞內源性IL-6對星形膠質細胞損傷修復的調節(jié)
　　目的：利用siIL-6 MSCs穩(wěn)定細胞株，與OGD損傷星形膠質細胞分離共培養(yǎng)，闡明MSCs內源性IL-6對損傷星形膠質細胞的作用。
　　方法：將siIL-6 MSCs

6、細胞與OGD損傷星形膠質細胞分離共培養(yǎng)，并以GFP MSCs為對照，ELISA測定共培養(yǎng)上清中IL-6分泌水平，Real-time PCR和western blotting分別檢測 IL-6信號通路關鍵分子IL-6R、STAT3及凋亡相關因子Bcl-2、Bax的mRNA及蛋白表達水平，鈣影像系統(tǒng)測定分離共培養(yǎng)后損傷星形膠質細胞胞內Ca2+濃度變化情況，CCK-8試劑盒檢測損傷星形膠質細胞的增殖情況。
　　結果：
　?。?）s

7、iIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)可明顯下調培養(yǎng)上清IL-6的分泌水平（P＜0.01）。
　　（2）siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后，OGD損傷星形膠質細胞中IL-6信號通路關鍵分子IL-6R與p-STAT3表達水平均顯著下降（P＜0.01，P＜0.01）。
　　（3）OGD損傷星形膠質細胞與siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后，其凋亡因子Bcl-2的表達水平明顯低于GFP MSCs組（P＜0.01），Bax表達水平略有增高，但

8、Bcl-2/Bax的表達水平比值顯著減小，與GFP MSCs組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。
　?。?）ATP可誘導與siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后的損傷星形膠質細胞內Ca2+釋放明顯增加（P＜0.05）。
　　（5）siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)促進損傷星形膠質細胞增殖能力增強。
　　結論當MSCs中IL-6分泌水平下降時，與其共培養(yǎng)的OGD損傷星形膠質細胞IL-6R/STAT3信號通路活性減弱，Bcl-

9、2/Bax表達水平比值下降，胞內Ca2+釋放增加，細胞增殖能力增強。
　　第三部分外源性細胞因子IL-6對OGD損傷星形膠質細胞的影響
　　目的：應用外源性細胞因子IL-6干預OGD損傷的星形膠質細胞，比較重組細胞因子IL-6與MSCs內源性分泌IL-6對損傷星形膠質細胞的作用。
　　方法：將重組細胞因子IL-6處理OGD損傷星形膠質細胞48h，并以IL-6未處理的OGD損傷星形膠質細胞為對照，ELISA測定培養(yǎng)上清中

10、IL-6的濃度，western blotting檢測兩組損傷星形膠質細胞中IL-6信號通路關鍵分子IL-6R、STAT3及凋亡相關因子Bcl-2、Bax的蛋白表達水平變化。鈣影像系統(tǒng)測定損傷星形膠質細胞中Ca2+濃度，CCK-8試劑盒檢測損傷星形膠質細胞的增殖情況。
　　結果：
　?。?）IL-6干預后，細胞培養(yǎng)上清中IL-6的濃度盡管較單獨OGD損傷組有所增高，但經統(tǒng)計學分析無顯著差異（P＞0.05）。
　?。?）外

11、源性IL-6可顯著上調IL-6R及磷酸化STAT3的表達水平。
　?。?）IL-6干預組細胞凋亡因子Bcl-2的蛋白表達水平明顯升高，Bax的表達水平顯著降低，Bcl-2/Bax表達水平比值顯著增加，與OGD損傷組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。
　?。?）ATP刺激可明顯誘導IL-6干預組中OGD損傷星形膠質細胞胞內Ca2+濃度的升高，但其升高幅度與單獨OGD損傷組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　?。?）損