來(lái)氟米特對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎防治作用的研究.pdf

1、 目的：觀察來(lái)氟米特(LEF)對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的防治作用。探討LEF對(duì)EAE防治作用的免疫學(xué)機(jī)制。方法：將60只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、EAE對(duì)照組及小、中、大劑量LEF防治組,每組12只。使用粗制髓鞘堿性蛋白(MBP)及完全弗氏佐劑制成免疫抗原,皮下注射制作 EAE 模型,空白對(duì)照組僅注射等量完全弗氏佐劑。自造模之日前三天起,小、中、大劑量LEF防治組分別予以LEF0.5mg/kg/d、2m

2、g/kg/d、8mg/kg/d灌胃,空白對(duì)照組及EAE對(duì)照組每日以生理鹽水2ml灌胃,連續(xù)10天。記錄Wistar大鼠發(fā)病率、發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期及發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分。在發(fā)病高峰期時(shí)處死大鼠,未發(fā)病及空白對(duì)照組4周后處死。留取大鼠腦脊髓組織、胸腺及眶靜脈血。大鼠腦脊髓組織處理后做HE 染色,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA )測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌 IL-4 及 IFN-γ水平,通過(guò)放射免疫法檢測(cè)腦組織細(xì)胞因子IL-

3、2、IL-6、TNF-α含量,通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血T細(xì)胞亞群分布以及胸腺細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：(1)Wistar大鼠發(fā)病情況：空白對(duì)照組大鼠未發(fā)??；EAE 對(duì)照組發(fā)病率 100%；小、中、大劑量LEF防治組部分動(dòng)物發(fā)病,發(fā)病率分別為83.33%、66.67%、58.33%。EAE對(duì)照組發(fā)病潛伏期11.00±1.28天,小、中、大劑量LEF防治組發(fā)病潛伏期分別為17.10±0.88天、20.63±1.06天、22.71±0.95天, LE

4、F 各防治組發(fā)病潛伏期均比 EAE 對(duì)照組長(zhǎng)(P<0.01),劑量依賴關(guān)系明顯。EAE 對(duì)照組發(fā)病進(jìn)展期 6.83±0.72 天,小、中、大劑量LEF防治組發(fā)病進(jìn)展期分別為5.20±0.79天、4.00±0.76天、3.00± 0.82天,LEF各防治組發(fā)病進(jìn)展期均比EAE對(duì)照組縮短(P<0.01),呈劑量依賴關(guān)系。EAE 對(duì)照組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分為 4.00 ±1.54 分,小、中、大劑量 LEF 防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙

5、評(píng)分為2.67±1.83、1.83±1.80分、1.17±1.34分,大、中劑量LEF防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分較EAE對(duì)照組評(píng)分低(P<0.01),小劑量LEF防治組與EAE對(duì)照組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；大劑量 LEF 防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分較小劑量LEF防治組低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),中劑量LEF防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分較小劑量 LEF 防治組低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05

6、)；大劑量LEF防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分較中劑量LEF防治組低,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2) EAE對(duì)照組及小、中、大劑量LEF防治組Wistar大鼠腦及脊髓病理學(xué)改變情況：空白對(duì)照組大鼠腦組織無(wú)異常。EAE對(duì)照組及LEF各防治組大鼠腦組織實(shí)質(zhì)內(nèi)血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),其中以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主同時(shí)伴有少量的單核細(xì)胞,典型者形成“袖套”樣的改變。LEF各防治組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重程度與EAE對(duì)照組相比病理改變減輕,

7、且劑量越大減輕程度越明顯。(3)LEF對(duì)EAE大鼠發(fā)病高峰期腦組織中 IL-2、IL-6、TNF-α含量的影響：EAE 對(duì)照組發(fā)病高峰期腦組織中IL-2、IL-6、TNF-α含量較空白對(duì)照組明顯增高(P<0.01),LEF 各防治組發(fā)病高峰期腦組織 IL-2、IL-6、TNF-α 含量較EAE 對(duì)照組明顯降低(P<0.01),大、中劑量 LEF 防治組大鼠發(fā)病高峰期腦組織IL-2、IL-6、TNF-α含量較小劑量LEF防治組組降低(P<

8、0.01),大劑量 LEF 防治組發(fā)病高峰期腦組織 IL-2、IL-6、TNF-α含量較中劑量LEF防治組降低(P<0.01)。(4)EAE對(duì)照組及LEF各防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4及INF-γ能力及其比值：EAE對(duì)照組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值較空白對(duì)照組降低(P<0.01),分泌 INF-γ 能力較空白對(duì)照組增強(qiáng)(P<0.01)；LEF各防治組PBMC分泌IL-4能力、IL-4/IN

9、F-γ值較EAE對(duì)照組明顯增高(P<0.01),分泌INF-γ能力較EAE對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；大、中劑量LEF防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值較小劑量LEF防治組明顯增高(P<0.01或P<0.05),分泌 INF-γ 能力較小劑量 LEF 防治組降低(P<0.01)；大劑量 LEF防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值較中劑量LEF組明顯增高(P<0.01)

10、,分泌INF-γ能力較中劑量LEF防治組降低(P<0.01)。(5)EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病高峰期T細(xì)胞亞群的分布變化：EAE組發(fā)病高峰期外周血T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+分布比例較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.01),CD4+/CD8+值明顯增高(P<0.01)；LEF各防治組發(fā)病高峰期期外周血CD4+、CD8+分布比例較EAE對(duì)照組明顯增高(P<0.01),CD4+/CD8+值明顯降低(P<0.01)；大、中劑量LEF防治組大

11、鼠發(fā)病高峰期外周血CD4+、CD8+分布比例較小劑量 LEF 組明顯增高(P<0.01),CD4+/CD8+值明顯降低(P<0.01),大劑量LEF防治組發(fā)病高峰外周血CD4+、CD8+分布比例較中劑量LEF組明顯增高(P<0.01),CD4+/CD8+值降低不明顯(P>0.05)。(6)EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病高峰期胸腺細(xì)胞凋亡率變化：EAE 對(duì)照組胸腺細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.01),LEF各防治組發(fā)病高峰期胸

12、腺細(xì)胞凋亡率較EAE對(duì)照組降低 (P<0.01)；大、中劑量LEF防治組胸腺細(xì)胞凋亡率較小劑量LEF防治組低(P<0.01),大劑量LEF防治組胸腺細(xì)胞凋亡率較中劑量LEF防治組低(P<0.01)。(7)相關(guān)性分析：EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病潛伏期與發(fā)病高峰期 IL-2、IL-6、TNF-α、CD4+/CD8+及胸腺細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)(P<0.01或P<0.05),與IL-4/INF-γ值呈正相關(guān)(P<0.01或P<0.05)；EA

13、E對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病進(jìn)展期與發(fā)病高峰期IL-2、IL-6、TNF-α、CD4+/CD8+及胸腺細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(P<0.01或P<0.05),與IL-4/INF-γ值呈負(fù)相關(guān)(P<0.01或P<0.05)；EAE對(duì)照組及 LEF 各防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分與發(fā)病高峰期 IL-2、IL-6、TNF-α、CD4+/CD8+及胸腺細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(P<0.01或P<0.05),與IL-4/INF-γ值呈負(fù)相關(guān)(P<0.01或P

14、<0.05)。結(jié)論：1. Wistar大鼠通過(guò)注入豚鼠脊髓勻漿可以成功制作EAE模型。2.EAE大鼠高峰期腦組織炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增多,Th1/Th2比例失衡,Th0分化向Th1漂移,T淋巴細(xì)胞亞群分布異常,胸腺細(xì)胞凋亡異常。3. LEF可以降低 EAE 大鼠發(fā)病率,延長(zhǎng)其發(fā)病潛伏期、縮短進(jìn)展期,同時(shí)減輕高峰期臨床癥狀、減輕腦脊髓炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),LEF對(duì)EAE大鼠發(fā)病具有防治作用。4.LEF 通過(guò)抑制 EAE 大鼠炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生、糾正Th