α-黑素細胞刺激素對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎防治作用的研究.pdf

1、目的：研究證實a—黑素細胞刺激素（a—melanocyte—stimulating hormone，a—MSH）具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。本研究通過觀察a—MSH對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎模型（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）發(fā)病情況、病理改變、外周血CD4+T細胞中CD4+CD25+FoxP3+Treg和Th17細胞所占比例、相關細胞因子的影響，探討a—MSH對EAE的發(fā)病有無保護

2、作用及可能的免疫學機制，為臨床治療多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）尋求新的藥物。 方法：將40只雌性豚鼠隨機分成4組：正常對照組、EAE對照組、EAE低劑量治療組和EAE高劑量治療組，每組各10只。自造模前7天開始，EAE低劑量治療組每日腹腔注射a—MSH（0.25mg/kg.d），EAE高劑量治療組每日腹腔注射a—MSH（1mg/kg.d），EAE對照組同時腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖溶液（phosphat

3、e buffered solution，PBS）液；正常對照組同時腹腔注射等體積生理鹽水。7天后開始造模，采用全脊髓勻漿（whole spinal cord homogenate，WSCH）抗原注入EAE對照組、EAE高及低劑量治療組豚鼠雙后足掌皮下及頸部皮下，每個點0.2ml，正常對照組注射等量生理鹽水。造模后高、低劑量治療組豚鼠按造模前的方法繼續(xù)皮下注射a—MSH予以保護，EAE對照組及正常對照組分別同時腹腔注射等體積PBS液和生理

4、鹽水，直至整個實驗結束。EAE對照組、EAE低劑量治療組和EAE高劑量治療組連續(xù)3天癥狀評分無加重或四肢癱瘓、死亡時作為EAE發(fā)病高峰期。記錄發(fā)病豚鼠的潛伏期、進展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評分；于發(fā)病高峰期處死豚鼠，未發(fā)病的觀察8周后處死，正常對照組8周后處死，留取豚鼠腦及脊髓組織，經(jīng)處理切片行HE染色，光學顯微鏡下觀察病理變化；留取各組豚鼠眶靜脈血，用流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞中CD4+CD25+FoxP3+Treg和Th17細

5、胞所占比例，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分泌干擾素—γ（interferon—γ，IFN—γ）、白細胞介素—4（interleukin—4，IL—4）、白細胞介素—17（interleukin—17，IL—17）的能力及外周血白細胞介素—23（interleukin—23，IL—23）水平。 結果： （1）豚鼠發(fā)病情況：

6、正常對照組豚鼠未發(fā)病。EAE高、低劑量治療組雖均有發(fā)病，但潛伏期相對較長，神經(jīng)功能障礙程度也相對較輕。EAE對照組發(fā)病潛伏期為（10.8±1.6）天，EAE低劑量治療組潛伏期（13.4±1.7天）較EAE對照組延長（P<0.05），EAE高劑量治療組潛伏期（17.0±1.3天）較EAE對照組及EAE低劑量組均明顯延長（P<0.01，P<0.01）； EAE對照組發(fā)病進展期為（5.9±0.9）天，EAE低劑量治療組進展期（4.1±1.1天

7、）較EAE對照組縮短（P<0.05），EAE高劑量治療組進展期（3.5±0.7天）較EAE對照組明顯縮短（P<0.01），但同EAE低劑量治療組比較沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）； EAE對照組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分為（3.4±0.6）分，EAE低劑量治療組神經(jīng)功能障礙評分（2.7±0.7分）較EAE對照組降低（P<0.05），EAE高劑量治療組神經(jīng)功能障礙評分（2.1±0.6分）較EAE對照組及EAE低劑量組均明顯降低（P<0.0

8、1，P<0.05）。 （2）腦及脊髓病理變化：正常對照組豚鼠腦和脊髓無異常。EAE對照組豚鼠高峰期可見腦及脊髓實質內(nèi)小血管充血，血管周圍主要是小靜脈周圍有大量炎性細胞浸潤，主要為單個核細胞浸潤，形成“袖套”狀改變，血管周圍白質明顯脫髓鞘改變。而治療組病理改變較輕，高劑量治療組最輕。 （3）各組豚鼠外周血外周血CD4+T細胞中CD4+CD25+FoxP3+Treg所占比例：正常對照組外周血CD4+CD25+FoxP3+Tr

9、eg細胞的比例為（5.81±0.28%），EAE對照組的比例（4.21±0.57%）較正常對照組明顯下降（P<0.01），EAE低、高劑量治療組的比例分別為（4.64±0.41%、5.52±0.44%），均較EAE對照組顯著升高（P<0.05，P<0.01），高劑量治療組較低劑量治療組升高更明顯（P<0.05）。 （4）各組豚鼠外周血CD4+T細胞中Th17細胞所占比例：正常對照組外周血Th17細胞的比例為（1.39±0.48%

10、），EAE對照組的比例（2.63±0.44%）較正常對照組明顯增高（P<0.01），EAE低、高劑量治療組的比例分別為（1.97±0.89%、1.42±0.66%），均較EAE對照組顯著降低（P<0.05，P<0.01），高劑量治療組較低劑量治療組降低更明顯（P<0.05）。 （5）各組豚鼠外周血PBMC分泌IFN—γ、IL—4、IL—17能力及外周血IL—23水平：EAE對照組豚鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IFN—γ、IL—17能

11、力及外周血IL—23水平較正常對照組升高（P值均<0.01），分泌IL—4能力較正常對照組降低（P<0.01）；a—MSH高、低劑量治療組豚鼠外周血IFN—γ、IL—17、IL—23能力較EAE對照組降低（P值均<0.01），分泌IL—4能力較EAE對照組升高（P<0.01，P<0.01）；a—MSH高劑量治療組較低劑量治療組分泌IFN—γ、IL—17、IL—23能力低（P值均<0.05），分泌IL—4能力較高（P值均<0.05）。

12、 （6）各組豚鼠外周血IFN—γ/IL—4比值：EAE對照組IFN—γ/IL—4比值較正常對照組明顯升高（P<0.01），EAE低、高劑量治療組IFN—γ/IL—4比值均較EAE對照組顯著下降（P<0.01，P<0.01），高劑量治療組下降更明顯（P<0.05）。 （7）相關性分析：EAE對照組及EAE各治療組外周血Th17細胞比例、PBMC分泌IL—17及IFN—γ能力、外周血IL—23水平、Th1/Th2細胞比值與EAE發(fā)病

13、的潛伏期呈負相關，（P<0.05），與進展期和發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分呈正相關（P<0.05）；而外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg比例、PBMC分泌IL—4能力與潛伏期呈正相關（P<0.05），與進展期及發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分呈負相關（P<0.05）；各組豚鼠外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg比例與Th17細胞比例呈負相關（P<0.05）；各組豚鼠外周血PBMC分泌IL—17能力、IL—23水平與Th1/Th

14、2細胞比值呈正相關（P<0.01）。 結論： （1）采用多點皮下單次注射WSCH建立EAE模型，EAE豚鼠神經(jīng)功能障礙癥狀明顯，腦和脊髓血管周圍炎性細胞浸潤、白質脫髓鞘，說明此法造模成功，可重復性好。 （2）EAE豚鼠體內(nèi)存在著免疫失衡。EAE對照組豚鼠發(fā)病高峰期體內(nèi)Th1型細胞因子IFN—γ增多，Th2型細胞因子IL—4減少，Th1/Th2細胞比例失衡，免疫格局向Th1型漂移；EAE對照組豚鼠Th17細胞比例及

15、Th17型細胞因子IL—17、IL—23增多；相反CD4+CD25+FoxP3+Treg比例下降，CD4+CD25+FoxP3+Treg/Th17免疫格局向Th17細胞一側漂移。 （3）Th17細胞與Th1細胞在發(fā)揮效應的過程中存在合作或協(xié)同關系；CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞與Th17細胞在功能上相互拮抗，分化上相互聯(lián)系，二者通過不同的細胞因子影響Th1/Th2細胞間平衡；相反Th1和Th2亦通過細胞因子的分泌影響

16、著CD4+CD25+FoxP3+Treg/Th17細胞平衡。 （4）α—MSH對EAE豚鼠發(fā)病具有保護作用：α—MSH能延長EAE發(fā)病潛伏期、縮短EAE發(fā)病進展期、減輕EAE豚鼠神經(jīng)功能障礙，α—MSH對EAE發(fā)病的保護作用大小與劑量有關，高劑量作用更明顯。 （5）α—MSH對EAE豚鼠發(fā)病的防護作用機制：可能是通過分泌細胞因子調(diào)節(jié)Th1/Th2及CD4+CD25+FoxP3+Treg/Th17細胞比例失衡而發(fā)揮其免疫抑