褪黑素對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠的神經(jīng)保護作用及其抗氧化應(yīng)激機制.pdf

1、目的：探討褪黑素(MT)對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)小鼠發(fā)病的神經(jīng)保護作用及其抗氧化應(yīng)激機制，為多發(fā)性硬化(MS)尋找新的治療藥物。
　　方法：將48只雌性C57BL/6小鼠(周齡6-8周，體重18-22g)隨機分成正常對照組、EAE對照組、MT干預(yù)組，每組16只;各組再隨機分為甲、乙兩個亞組。利用MOG35-55多肽、完全弗氏佐劑(CFA)、結(jié)核桿菌H37Ra、百日咳毒素(PTX)等對EAE對照組和MT干預(yù)組小鼠進行免疫

2、制備EAE動物模型。正常對照組僅注射不含MOG35-55的CFA。以Benson5分評分標(biāo)準每天對小鼠進行1次神經(jīng)功能障礙評分，并記錄各組小鼠活動、進食、毛發(fā)、體重等情況。自造模當(dāng)天開始MT干預(yù)組給予腹腔注射MT10 mg/kg(10mg/ml)，而正常對照組與EAE對照組每日腹腔注射生理鹽水1ml/kg。EAE對照組和MT干預(yù)組按照上述要求連續(xù)注射藥物至發(fā)病高峰期，處死小鼠取材。若小鼠連續(xù)3天評分無加重、四肢完全癱瘓、瀕臨死亡或者死亡

3、作為EAE發(fā)病高峰期。正常對照組及其余未發(fā)病小鼠則于造模后28天處死、取材。所有甲亞組小鼠經(jīng)4％甲醛灌注固定后取脊髓，乙亞組則在冰盤上斷頭迅速取出腦組織，制作成腦組織勻漿，離心后取上清液放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。待所有小鼠全部取材完畢后，甲亞組用免疫組化法觀察脊髓轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達情況，以及用HE染色觀察脊髓實質(zhì)中炎性細胞浸潤及特殊的“血管袖套”現(xiàn)象;乙亞組則分別用黃嘌呤氧化酶

4、法和紫外分光法檢測腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)活力;用比色法和化學(xué)熒光法檢測組織勻漿中硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（TBARS）和活性氧(ROS)含量。
　　結(jié)果：⑴實驗小鼠發(fā)病情況觀察:正常對照組中無發(fā)病小鼠。EAE對照組、MT干預(yù)組均有不同程度發(fā)病，其發(fā)病率分別為81.2％、56.3％（P＞0.05）。⑵實驗小鼠神經(jīng)功能障礙評分、潛伏期及進展期變化:EAE對照組和MT干預(yù)組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分分別為

5、2.8±1.0分、1.4±0.7分。MT干預(yù)組小鼠神經(jīng)功能障礙程度較EAE對照組明顯減輕（P＜0.05）。MT干預(yù)組的發(fā)病潛伏期為15.23±1.86天，較EAE對照組的發(fā)病潛伏期（12.77±1.92天）明顯延長(P＜0.05)。MT干預(yù)組的發(fā)病進展期為4.00±0.87天，較EAE對照組的進展期（6.92±1.80天）明顯縮短（P＜0.05）。⑶組織病理改變:正常對照組小鼠脊髓組織無異常。EAE對照組小鼠發(fā)病高峰期可見脊髓實質(zhì)內(nèi)大量

6、炎性細胞浸潤，典型者可在小靜脈周圍形成“袖套”狀改變，在脊髓的腰膨大前正中裂周圍這種改變較為明顯。而MT干預(yù)組炎性細胞浸潤情況較EAE對照組有所減輕，“血管袖套”現(xiàn)象也較少見。⑷各組小鼠腦組織勻漿SOD和CAT活力:發(fā)病高峰期，正常對照組、EAE對照組、MT干預(yù)組SOD活力分別是164.72±6.68、107.09±26.41、132.13±17.72U/mgprot。正常對照組、EAE對照組、MT干預(yù)組CAT活力分為10.69±0.7

7、0、5.69±1.67、7.50±2.24 umol/mgprot。EAE對照組、MT干預(yù)組SOD及CAT活力較正常對照組均明顯降低（P＜0.05）;MT干預(yù)組SOD及CAT活力較EAE對照組均明顯升高（P＜0.05）。⑸各組小鼠腦組織勻漿TBARS和ROS含量:發(fā)病高峰期，正常對照組、EAE對照組、MT干預(yù)組TBARS含量分別是19.50±3.47、38.77±12.32、28.86±7.52 ug/g，正常對照組、EAE對照組、MT

8、干預(yù)組ROS含量分別為47.00±4.53、92.63±25.03、69.00±17.25ηnmol/mgprot。 EAE對照組、MT干預(yù)組TBARS和ROS含量均顯著高于正常對照組（P＜0.05），MT干預(yù)組TBARS和ROS含量較EAE對照組明顯下降（P＜0.05）。⑹實驗小鼠脊髓Nrf2和HO-1表達:發(fā)病高峰期，正常對照組、EAE對照組、MT干預(yù)組脊髓Nrf2表達陽性細胞計數(shù)分別是15.13±3.27、27.63±3.58、5

9、4.88±10.01個，正常對照組、EAE對照組、MT干預(yù)組脊髓HO-1陽性細胞計數(shù)分別為11.50±2.82、30.38±9.72、48.88±13.97個。EAE對照組和MT干預(yù)組Nrf2及HO-1的表達均較正常對照組小鼠明顯升高（P＜0.05），MT干預(yù)組Nrf2和HO-1表達較EAE對照組升高更明顯（P＜0.05）。⑺相關(guān)性分析:EAE對照組和MT干預(yù)組小鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分與腦組織勻漿SOD和CAT活力及脊髓組織Nrf

10、2和HO-1表達呈負相關(guān)(P＜0.05);與腦組織勻漿TBARS和ROS含量呈正相關(guān)(P＜0.05)。EAE對照組和MT干預(yù)組小鼠潛伏期與腦組織勻漿SOD和CAT活力及脊髓組織Nrf2和HO-1表達呈負相關(guān)(P＜0.05);與腦組織勻漿TBARS和ROS含量呈正相關(guān)(P＜0.05)。EAE對照組和MT干預(yù)組小鼠進展期與腦組織勻漿SOD和CAT活力及脊髓組織Nrf2和HO-1表達呈負相關(guān)(P＜0.05);與腦組織勻漿TBARS和ROS含量

11、呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：①本實驗采用皮下注射MOG35-55多肽建立EAE模型，發(fā)病小鼠神經(jīng)功能障礙明顯，脊髓實質(zhì)中有大量的炎性細胞浸潤，在血管周圍細胞聚集可呈“袖套狀”改變，說明此法造模成功，可重復(fù)性好。②EAE發(fā)病中存在著氧化和抗氧化失衡，TBARS、ROS含量增加，抗氧化酶SOD、CAT活力降低，氧化應(yīng)激損害可能是導(dǎo)致EAE不斷進展的一個重要因素。③MT可以降低EAE小鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分、延長潛伏期、