多西環(huán)素對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎防治作用的研究.pdf

1、目的:1.觀察多西環(huán)素(DOX)在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)大鼠發(fā)病過程中的防治作用;2.探討DOX對(duì)防治EAE大鼠發(fā)病可能的免疫學(xué)機(jī)制。
　　方法:隨機(jī)將50只雌性Wistar大鼠分為正常對(duì)照組、EAE對(duì)照組、大劑量DOX防治組、中劑量DOX防治組、小劑量DOX防治組5組，每組10只。采用粗制髓鞘堿性蛋白(MBP)和含卡介苗(BCG)的完全福氏佐劑(CFA)制成免疫抗原，皮下注入EAE對(duì)照組及大、中、小劑量DOX防治組大

2、鼠后足掌，同法給正常對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水(NS)。自造模前三天起，分別給予大、中、小劑量DOX防治組大鼠DOX20mg/kg/d、10mg/kg/d、5mg/kg/d腹腔注射，正常對(duì)照組及EAE對(duì)照組大鼠予以等量NS腹腔注射，均連續(xù)10天。將發(fā)病大鼠連續(xù)3天神經(jīng)功能障礙評(píng)分無加重、四肢癱瘓或死亡時(shí)作為發(fā)病高峰期。觀察大鼠發(fā)病情況，并記錄發(fā)病潛伏期和進(jìn)展期以及高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分。在大鼠發(fā)病高峰期終止實(shí)驗(yàn)，處死大鼠，未發(fā)病大鼠及正

3、常對(duì)照組大鼠4周后處死，并留取眶靜脈血、腦脊液(CSF)、腦脊髓組織、脾臟組織。將腦脊髓組織行HE染色并在光鏡下觀察其病理學(xué)改變及程度;用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)大鼠發(fā)病高峰期外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌IL-4、IL-17、IL-23、IFN-γ、TGF-β1水平及腦組織勻漿MMP-2、MMP-9水平;流式細(xì)胞儀測(cè)定脾臟Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群分布比率;測(cè)定血清和CSF白蛋白含量，計(jì)算CSF

4、和血清白蛋白含量比值即QA值，評(píng)估血腦屏障(BBB)功能。所獲得的數(shù)據(jù)通過SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:(1)大鼠發(fā)病情況:正常對(duì)照組大鼠未見異常。EAE對(duì)照組及大、中、小劑量DOX防治組發(fā)病率分別為90％、40％、60％、80％。EAE對(duì)照組及大、中、小劑量DOX防治組發(fā)病潛伏期分別為11.3±1.5天、23.7±1.9天、20.6±1.2天、17.7±1.0天，各劑量DOX防治組發(fā)病潛伏期均較EAE對(duì)照組延

5、長（P＜0.01），大劑量DOX防治組大鼠發(fā)病潛伏期延長最明顯，各劑量DOX防治組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。EAE對(duì)照組及大、中、小劑量DOX防治組發(fā)病進(jìn)展期分別為10.1±1.0天、4.4±0.6天、6.9±0.4天、7.7±0.7天，各劑量DOX防治組發(fā)病進(jìn)展期均較EAE對(duì)照組縮短（P＜0.01），其中以大劑量組大鼠發(fā)病進(jìn)展期縮短最明顯，各劑量DOX防治組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。EAE對(duì)照組及大、

6、中、小劑量DOX防治組大鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分分別為4.3±0.7分、1.1±0.4分、1.9±0.3分、3.0±0.3分，各劑量DOX防治組神經(jīng)功能障礙評(píng)分均較EAE對(duì)照組降低(P＜0.01)，其中以大劑量組降低最明顯，各劑量DOX防治組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(2)病理學(xué)改變:正常對(duì)照組大鼠腦脊髓組織未見明顯異常。EAE對(duì)照組大鼠腦脊髓組織內(nèi)可見小血管周圍以淋巴細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤，并伴少許單核細(xì)胞，典型者形

7、成“血管套”樣改變。而各劑量DOX防治組病理改變均較EAE對(duì)照組減輕，其中以大劑量DOX防治組最輕。(3) DOX對(duì)EAE大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比值的影響:EAE對(duì)照組和各劑量DOX防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4比值較正常對(duì)照組升高，EAE對(duì)照組和中小劑量DOX防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4水平較正常組降低(P＜0.01)，大劑量組IFN-

8、γ水平較正常對(duì)照組改變不明顯(P＞0.05);各劑量DOX防治組大鼠PBMC分泌IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4比值較EAE對(duì)照組降低、IL-4水平較EAE對(duì)照組升高(P＜0.01);隨DOX劑量增加，各劑量DOX防治組大鼠PBMC分泌IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值越低、IL-4水平越高，除大劑量DOX防治組大鼠PBMC分泌IL-4水平較中劑量組改變不明顯外(P＞0.05)，余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。(4)

9、 DOX對(duì)EAE大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-17、IL-23、TGF-β1水平的影響:除大劑量DOX防治組PBMC分泌IL-17、IL-23水平較正常對(duì)照組升高不明顯(P＞0.05)外，EAE對(duì)照組和各劑量DOX防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-17、IL-23水平較正常對(duì)照組升高，TGF-β1水平較正常對(duì)照組降低(P＜0.01);各劑量DOX防治組大鼠PBMC分泌IL-17、IL-23水平較EAE對(duì)照組降低、TGF-β1水平較

10、EAE對(duì)照組升高(P＜0.01);隨DOX劑量增加，各劑量DOX防治組大鼠PBMC分泌IL-17、IL-23水平越低、TGF-β1水平越高，除大劑量DOX防治組大鼠PBMC分泌TGF-β1水平較中劑量組改變不明顯外(P＜0.05)，余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(5) DOX對(duì)EAE大鼠發(fā)病高峰期脾臟Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群分布比率的影響:EAE對(duì)照組和中、小劑量DOX防治組大鼠發(fā)病高峰期脾臟

11、Th17細(xì)胞比率較正常對(duì)照組升高，脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率較正常對(duì)照組降低（P＜0.01），大劑量DOX防治組大鼠發(fā)病高峰期脾臟Th17細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率較正常組改變不明顯(P＞0.05);各劑量DOX防治組大鼠脾臟Th17細(xì)胞比率較EAE對(duì)照組降低、脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率較EAE對(duì)照組升高(P＜0.01);隨DOX劑量增加，各劑量DOX防治組大鼠脾

12、臟Th17細(xì)胞比率越低、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率越高，各劑量DOX防治組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(6) DOX對(duì)EAE大鼠發(fā)病高峰期腦組織MMP-2、MMP-9水平及QA值的影響:除大劑量DOX防治組大鼠腦組織MMP-2水平較正常對(duì)照組升高不明顯(P＞0.05)外，EAE對(duì)照組及各劑量DOX防治組大鼠發(fā)病高峰期腦組織MMP-2、MMP-9水平及QA值較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01或P＜0.05)，各劑量DOX防治組

13、大鼠發(fā)病高峰期腦組織MMP-2、MMP-9水平及QA值較EAE對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），隨DOX劑量增加，各劑量DOX防治組大鼠腦組織MMP-2、MMP-9水平及QA值水平越低，各DOX防治組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。(7)相關(guān)性分析:EAE對(duì)照組及各劑量DOX防治組大鼠發(fā)病潛伏期與高峰期IFN-γ/IL-4比值、IL-17、MMP-2、MMP-9、QA值、Th17細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01或P＜0.0

14、5），與發(fā)病高峰期TGF-β1、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率呈正相關(guān);EAE對(duì)照組及各劑量DOX防治組大鼠發(fā)病進(jìn)展期與高峰期IFN-γ/IL-4比值、IL-17、MMP-2、MMP-9、QA值、Th17細(xì)胞比率呈正相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)，與發(fā)病高峰期TGF-β1、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān);EAE對(duì)照組及各劑量DOX防治組大鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分與高峰期IFN-γ/IL-4

15、比值、IL-17、MMP-2、MMP-9、QA值、Th17細(xì)胞比率呈正相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)，與發(fā)病高峰期TGF-β1、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:1.在EAE發(fā)病高峰期，大鼠外周血促炎因子增多、抑炎因子減少，脾臟Th17比率增高、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率降低，存在體內(nèi)Th1/Th2平衡及Th17/CD4+CD25+Foxp3+Treg平衡漂移。2.在EAE

16、發(fā)病高峰期，大鼠腦組織MMP-2、MMP-9水平升高以及腦脊液和血清蛋白比值QA值升高，提示BBB破壞。3.DOX可降低EAE大鼠的發(fā)病率，延長EAE大鼠發(fā)病潛伏期、縮短進(jìn)展期、降低發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分，減輕CNS炎癥細(xì)胞浸潤，提示DOX對(duì)EAE發(fā)病有防治作用。4.DOX通過抑制促炎性細(xì)胞因子的生成、促進(jìn)抑炎性細(xì)胞因子的釋放，降低脾臟Th17比率、升高CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率，降低腦組織MMP-2、MMP-9