苦參素對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠防治作用的研究.pdf

1、目的:觀察苦參素(MAT)對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的防治作用，探討MAT對(duì)EAE大鼠防治作用的機(jī)制，為其治療多發(fā)性硬化(MS)尋找理論依據(jù)。
　　方法:將6-7周齡、體重180-220g的雌性Wistar實(shí)驗(yàn)大鼠50只按每組10只的數(shù)量隨機(jī)分成5組。以豚鼠脊髓勻漿(GPSCH)作為致敏抗原，完全福氏佐劑(CFA)作為抗原佐劑，兩者混合后制成致敏劑對(duì)隨機(jī)選出的4組大鼠進(jìn)行致敏后建立EAE模型，并設(shè)為EAE對(duì)照組，低、中、

2、高劑量MAT組(MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組)，剩余1組為正常對(duì)照組。自造模當(dāng)日起，正常對(duì)照組和EAE對(duì)照組不做任何處理常規(guī)飼養(yǎng)，MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組連續(xù)15日分別應(yīng)用MAT膠囊50 mg/kg·d、100mg/kg·d、200mg/kg·d劑量灌胃一次。造模后需每日定時(shí)觀察各組Wistar實(shí)驗(yàn)大鼠的臨床表現(xiàn)如精神飲食、體重變化、肢體活動(dòng)等以確定發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期，并進(jìn)行高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分。未發(fā)病的大

3、鼠觀察1月后處死，發(fā)病的EAE大鼠以連續(xù)3天觀察神經(jīng)功能障礙評(píng)分未加重，或出現(xiàn)嚴(yán)重共濟(jì)失調(diào)、肢體完全癱瘓、瀕死的時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)終止時(shí)間。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)終止時(shí)留取大鼠外周靜脈血、腦組織等保存待檢測(cè)。通過(guò)病理檢查、ELISA等檢測(cè)方法，觀察大鼠發(fā)病高峰期腦組織炎癥病理改變及腦組織勻漿中Th1、Th2、Th17代表性細(xì)胞因子濃度變化和靜脈血髓鞘堿性蛋白(MBP)濃度、T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+)比例變化。根據(jù)EAE和MS的免疫機(jī)制選定γ-干

4、擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)分別作為T(mén)h1、Th2、Th17代表性細(xì)胞因子。通過(guò)SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠發(fā)病情況:
　　(1)臨床表現(xiàn):正常對(duì)照組大鼠精神、飲食、睡眠及活動(dòng)同平時(shí)，未見(jiàn)有發(fā)病表現(xiàn)。EAE大鼠造模后不同程度出現(xiàn)毛色暗淡、精神差、飲食睡眠下降、活動(dòng)減少、尾巴無(wú)力、肢體癱瘓、大小便失禁，甚至抽搐死亡等現(xiàn)象。各MAT組

5、大鼠的臨床表現(xiàn)較EAE對(duì)照組輕，其中以MAT-H組最輕。
　　(2)發(fā)病潛伏期:EAE大鼠發(fā)病潛伏期時(shí)間以EAE對(duì)照組最短，為9.30±0.94天;MAT-H組最長(zhǎng)，為16.60±0.97天。與EAE對(duì)照組相比，各MAT組潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)顯著(P＜0.01);MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠潛伏期時(shí)間依次延長(zhǎng)，各MAT組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　(3)疾病進(jìn)展期:各組EAE大鼠疾病進(jìn)展期時(shí)間以EA

6、E組最長(zhǎng)，為7.20±1.14天;MAT-H組最短，為2.90±0.74天。與EAE對(duì)照組相比，各MAT組進(jìn)展期時(shí)間顯著變短(P＜0.01);MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠進(jìn)展期時(shí)間依次縮短，各MAT組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　(4)發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分:疾病高峰期各組EAE大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分以EAE對(duì)照組最高，為3.70±0.95分;MAT-H組最低，為2.00±0.82分。與EAE對(duì)照組

7、相比，各MAT組神經(jīng)功能障礙評(píng)分顯著下降(P＜0.01、P＜0.05);MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分依次降低，各MAT組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　(5)發(fā)病癥狀嚴(yán)重程度及死亡率:各組EAE大鼠發(fā)病癥狀及死亡率以EAE對(duì)照組最高，MAT-H組最低;與EAE對(duì)照組相比，各MAT組發(fā)病癥狀及死亡率降低(P＜0.01、P＜0.05)。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠發(fā)病癥狀及死

8、亡率依次降低，各MAT組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　2.中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)病理變化:
　　(1)腦組織病理變化:各組EAE大鼠腦組織均可見(jiàn)數(shù)量不等的炎性細(xì)胞，對(duì)腦組織及血管的浸潤(rùn)程度不同，以EAE對(duì)照組最為明顯，MAT-H組最輕，正常對(duì)照組未見(jiàn)異常。EAE對(duì)照組腦組織病理切片改變典型，表現(xiàn)為散在白質(zhì)炎性脫髓鞘及少突膠質(zhì)細(xì)胞破壞，嚴(yán)重可見(jiàn)軸索結(jié)構(gòu)破壞，呈空泡樣缺失。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大

9、鼠腦組織炎癥病理改變程度依次減輕。
　　(2)腦組織炎癥病理評(píng)分:各組EAE大鼠病理評(píng)分以EAE對(duì)照組最高，為2.9±0.32分;MAT-H組最低，為1.2±0.63分。與EAE對(duì)照組相比，各MAT組病理評(píng)分降低明顯(P＜0.01、P＜0.05);MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠腦組織炎癥病理評(píng)分依次降低，各MAT組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01、P＜0.05)。
　　3.大鼠腦組織勻漿中細(xì)胞因子含量變化:與

10、正常對(duì)照組腦組織勻漿中IFN-γ、IL-17濃度及IFN-γ/IL-4值相比，EAE對(duì)照組、各MAT組其值顯著上升(P＜0.01);與EAE對(duì)照組相比，各MAT組腦組織勻漿中IFN-γ、IL-17濃度及IFN-γ/IL-4值水平明顯下降(P＜0.01)。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠腦組織勻漿中IFN-γ、IL-17濃度及IFN-γ/IL-4值依次下降，各MAT組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01、P＜0.05)。與正常對(duì)

11、照組腦組織勻漿中IL-4濃度相比，EAE對(duì)照組、各MAT組其濃度水平下降明顯(P＜0.01);與EAE組相比，各MAT組腦組織勻漿中IL-4濃度水平明顯上升(P＜0.01)。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠腦組織勻漿中IL-4濃度依次升高，各MAT組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　4.大鼠靜脈血中MBP濃度:與正常對(duì)照組靜脈血中MBP濃度相比，EAE對(duì)照組、各MAT組其濃度水平顯著上升(P＜0.01);與E

12、AE對(duì)照組相比，各MAT組靜脈血中MBP濃度水平明顯下降(P＜0.01)。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠靜脈血中MBP濃度依次下降，各MAT組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01、P＜0.05)。
　　5.T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+)比例變化:與正常對(duì)照組大鼠相比，EAE對(duì)照組、各MAT組靜脈血中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞比例降低（P＜0.01、P＜0.05），CD4+/CD8+值升高(P＜0.05)。與EAE

13、對(duì)照組相比，各MAT組靜脈血中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞比例升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+值降低(P＜0.01)。與MAT-L組相比，MAT-M組、MAT-H組靜脈血中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞比例升高(P＜0.01、P＜0.05)，CD4+/CD8+值降低(P＜0.01、P＜0.05)。與MAT-M組相比，MAT-H組靜脈血中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞比例升高(P＜0.01、P＜0.05)，CD4+/CD8+值降低(P＜0.

14、05)。
　　6.大鼠發(fā)病高峰期免疫生化指標(biāo)與臨床及病理相關(guān)性分析:
　　(1)EAE對(duì)照組及各MAT組大鼠腦組織勻漿中IFN-γ水平與發(fā)病潛伏期呈負(fù)相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);與疾病進(jìn)展期、高峰期神經(jīng)系統(tǒng)功能受損、腦組織炎癥病理改變呈正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　　(2) EAE對(duì)照組及各MAT組大鼠腦組織勻漿中IL-4水平與發(fā)病潛伏期呈正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01、P＜0.05);與

15、疾病進(jìn)展期、高峰期神經(jīng)系統(tǒng)功能受損、腦組織炎癥病理改變呈負(fù)相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01、P＜0.05)。
　　(3) EAE對(duì)照組及各MAT組大鼠腦組織勻漿中IL-17水平與發(fā)病潛伏期呈負(fù)相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01、P＜0.05)，與疾病進(jìn)展期、高峰期神經(jīng)系統(tǒng)功能受損、腦組織炎癥病理改變呈正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01、P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.EAE大鼠發(fā)病高峰期機(jī)體免疫失去平衡，CD

16、4+、CD8+淋巴細(xì)胞比例下降，兩者比值上升;促炎癥因子IFN-γ、IL-17分泌增加，抗炎癥因子IL-4分泌減少;MBP濃度升高。
　　2.MAT具有減輕EAE大鼠的發(fā)病癥狀程度，使發(fā)病潛伏期延長(zhǎng)、疾病進(jìn)展期縮短，降低發(fā)病高峰期神經(jīng)系統(tǒng)功能受損，減輕腦組織炎癥細(xì)胞的病理?yè)p害作用，其影響程度與MAT劑量大小呈正相關(guān)。
　　3.MAT防治EAE大鼠機(jī)制可能與使CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞比例上升，兩者比值下降;降低促炎癥因子IF