促紅細(xì)胞生成素治療小鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的觀察.pdf

1、第一部分:促紅細(xì)胞生成素治療小鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎
　　目的:觀察促紅細(xì)胞生成素(crytbxopoietin,EPO)對實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)小鼠模型治療效果。
　　方法:將EAE小鼠隨機(jī)分為PBS對照組(EAEcontrol)、預(yù)防性EPO干預(yù)組(EPOpremorbid)以及治療性EPO干預(yù)組(EPOpostmorbi

2、d),觀察EAE臨床癥狀和體重變化;HE染色觀察脊髓炎性細(xì)胞浸潤,應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察腦和脊髓細(xì)胞亞群以及相關(guān)細(xì)胞因子。
　　結(jié)果:同EAEcontrol相比,EPOpremorbid和EPOpostmorbid組小鼠起病時間較晚,臨床癥狀較輕,腰骶部脊髓浸潤細(xì)胞較少(P＜0.05);EPOpremorbid浸潤細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞、IL-17+CD4+T細(xì)胞以及IFNI-γ+CD4+T細(xì)胞比例均顯著低于EAEeontrol(P＜0

3、.05)。
　　結(jié)論:EPO可改善EAE小鼠臨床癥狀,減少病灶浸潤炎性細(xì)胞以及炎性因子。
　　第二部分:促紅細(xì)胞生成素受體表達(dá)
　　目的:觀察EPO受體在外周免疫細(xì)胞和中樞膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)。
　　方法:從EAE脾臟和外周淋巴結(jié)中提取單個核細(xì)胞,并進(jìn)一步純化提取CD4+T細(xì)胞;培養(yǎng)并鑒定原代星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞;應(yīng)用RT-PCR觀察EPO受體的表達(dá)。
　　結(jié)果:在外周,EPO受體可表達(dá)在單個核細(xì)胞,但不表

4、達(dá)在CD4+T細(xì)胞;在中樞,EPO受體均可表達(dá)在靜息態(tài)和LPS激活態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　結(jié)論:EPO受體在外周免疫細(xì)胞和中樞膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)。
　　第三部分:EPO對外周單個核細(xì)胞免疫功能的影響
　　目的:探討EPO是否可通過對外周免疫細(xì)胞的作用而實(shí)現(xiàn)對炎性細(xì)胞功能的抑制。
　　方法:應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察,EAEcontrol和EPOpremorbid組外周單個核細(xì)胞(Mononuclear cel

5、ls,MNC和MNCe)亞群以及MHC-Ⅱ和細(xì)胞因子表達(dá);植物血球凝集素(PHA)或MOG35-55抗原刺激外周免疫細(xì)胞后,MTT法觀察細(xì)胞增殖,同時應(yīng)用ELISA和RT-PCR觀察細(xì)胞因子變化。
　　結(jié)果:MNCe中CD4+T細(xì)胞、IL-17+CD4+T細(xì)胞和(或)IFN-γ+CD4+T細(xì)胞、MHC-Ⅱ比例均顯著低于MNC(P＜0.05):PHA非特異性刺激后,MNCe的IL-17、IL-23、IL-6和IFN-γ低于MNC(P

6、＜0.05),而兩者的增殖率無顯著差異(P＞0.05);EPO和MOG35-55抗原共同處理后MNC所產(chǎn)生的IL-17、IFN-γ、IL-23低于單獨(dú)用MOG35-55抗原刺激后MNC(P＜0.05);EPO和MOG35-55抗原共同處理后CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-γ低于單獨(dú)用MOG35-55抗原刺激后CD4+T細(xì)胞(P＜0.01)。
　　結(jié)論:EPO可以抑制外周單個核細(xì)胞IL-17和IFN-γ等炎性因子分泌,其機(jī)制可能同下調(diào)

7、IL-23和MHC-Ⅱ水平有關(guān)。
　　第四部分:EPO對星形膠質(zhì)細(xì)胞與EAE免疫細(xì)胞相互作用的影響
　　目的:探討EPO可否通過對星形膠質(zhì)細(xì)胞作用,影響它們同EAE小鼠外周免疫細(xì)胞的相互作用。
　　方法:EPO處理靜息態(tài)和LPS/IFN-γ激活態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞后,應(yīng)用ELISA和RT-PCR等方法,觀察細(xì)胞因子變化;MTT法觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖;利用細(xì)胞免疫化學(xué)和流式細(xì)胞儀,觀察MHC-Ⅱ表達(dá)水平的差異。EPO處理前后,

8、靜息態(tài)和LPS/IFN-γ激活態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞,分別以1:1或1:5比例同MNC和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),應(yīng)用ELISA觀察細(xì)胞因子分泌,流式細(xì)胞儀觀察MHC-Ⅱ表達(dá)。
　　結(jié)果:1)EPO抑制靜息態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6和LPS激活態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-23以及MHC-Ⅱ表達(dá)(P＜0.05);2)EPO可促星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖以及一氧化氮(nitricoxide,NO)釋放;3)靜息態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)EPO處

9、理后,可使其與MNC以1:1比例共培養(yǎng)中IFN-γ、IL-10和IL-6降低(P＜0.05),與MNC以1:5比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ、IL-17以及IL-23降低(P＜0.05);4)激活態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)EPO處理后,可使其與CD4+T細(xì)胞以1:1比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-23降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:EPO促進(jìn)靜息星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和NO釋放,抑制LPS/IFN-γ激活態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞MH

10、C-Ⅱ以及IL-17、IL-23和IL-27表達(dá)。EPO預(yù)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞可在與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)中抑制IL-17或(和)IFN-γ,其機(jī)制可能同下調(diào)MHC-Ⅱ和(或)IL-23等有關(guān)。
　　第五部分:EPO對小膠質(zhì)細(xì)胞與EAE免疫細(xì)胞相互作用的影響
　　目的:探討EPO可否通過對小膠質(zhì)細(xì)胞作用,影響它們同EAE小鼠免疫細(xì)胞的相互作用。
　　方法:EPO處理靜息態(tài)和LPS/IFN吖激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞后,應(yīng)用ELISA和RT

11、-PCR等方法,觀察細(xì)胞因子變化;LDH測定觀察小膠質(zhì)細(xì)胞死亡;利用細(xì)胞免疫化學(xué)和流式細(xì)胞儀,觀察MHC-Ⅱ表達(dá)水平的差異。EPO處理前后,靜息態(tài)和LPS/IFN-γ激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞,分別以1:1或1:5比例同MNC和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),應(yīng)用ELISA觀察細(xì)胞因子分泌,流式細(xì)胞儀觀察MHC-Ⅱ表達(dá)。
　　結(jié)果:1)EPO抑制激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-23以及MHC-Ⅱ表達(dá)(P＜0.05);2)EPO

12、可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞死亡;3)靜息態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)EPO處理后,可使其與CD4+T細(xì)胞以1:1比例共培養(yǎng)中IL-6、IL-17、IL-23降低(P＜0.05),與CD4+T細(xì)胞以1:5比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ、IL-23降低(P＜0.05),與MNC以1:1比例共培養(yǎng)中IFN-γ降低,IL-10升高(P＜0.05);4)激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)EPO處理后,可使其與CD4+T細(xì)胞以1:1比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ、IL-23降低(P

13、＜0.05),與MNC以1:1比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ降低(P＜0.05);5)與MNC共培養(yǎng)的靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞,MHC-Ⅱ表達(dá)上調(diào)(P＜0.05),若小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)EPO預(yù)處理,則MHC-Ⅱ表達(dá)可被抑制(P＜0.05)。
　　結(jié)論:EPO抑制靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞死亡,抑制LPS/IFN-γ激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞MHC-Ⅱ表達(dá)以及IL-17、IL-23、IL-27產(chǎn)生。EPO對靜息或激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的預(yù)處理,使得其與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)中I

14、L-17和(或)IFN-γ降低,其機(jī)制可能同下調(diào)IL-23和MHC-Ⅱ表達(dá)有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.EPO可減輕EAE病灶炎性細(xì)胞浸潤,改善臨床癥狀。
　　2.外周單個核細(xì)胞和中樞膠質(zhì)細(xì)胞上均有EPO受體表達(dá),EPO可直接作用于這些細(xì)胞,但CD4+T細(xì)胞并不表達(dá)EPO受體。
　　3.激活態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)MHC-Ⅱ,同時有IL-17、IL-23和IL-27產(chǎn)生,而EPO則可抑制這些功能分子的表達(dá)。