蘇木醇提物對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎防治作用的研究.pdf

1、背景：多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)白質(zhì)脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病，其目前治療多使用免疫抑制劑，此療法的主要弊端在于廣泛的抑制了機(jī)體的免疫功能。近年來發(fā)現(xiàn)中藥蘇木(Caesalpinia sappan L，CSL)作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，既能達(dá)到預(yù)防和治療自身免疫性疾病的目的，又不引起廣泛的免疫抑制作用，目前尚無蘇木治療MS的研究報(bào)

2、道。實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)是目前公認(rèn)的人類多發(fā)性硬化理想的動(dòng)物模型，為了探討預(yù)防和治療多發(fā)性硬化新途徑或新藥物，我們作了蘇木醇提物對(duì)EAE防治作用的研究。 目的：通過觀察蘇木醇提物對(duì)EAE豚鼠發(fā)病情況、病理改變、T細(xì)胞亞群分布、細(xì)胞因子含量、Th1/Th2平衡的影響，探討蘇木醇提物對(duì)EAE發(fā)病有無保護(hù)作用及可能的免疫學(xué)作用機(jī)制，為治療MS

3、尋找新的藥物。 方法：采用粗制堿性髓鞘蛋白(coarsemyelin basic protein，CMBP)加福氏完全佐劑(complete Freud’s adjuvant，CFA)皮下注射的方法建立EAE模型，EAE模型分為蘇木高、中、低劑量治療組和EAE對(duì)照組，各組10只；正常對(duì)照組10只，按EAE模型組的方法注射生理鹽水及CFA。從造模前3天開始，蘇木高劑量治療組灌喂蘇木醇提物2ml/只天；蘇木中劑量治療組灌喂蘇木醇提物

4、1ml以及1ml生理鹽水/只天；蘇木低劑量治療組灌喂蘇木醇提物0.5ml以及1.5ml生理鹽水/只天；正常對(duì)照組及EAE對(duì)照組灌喂等體積的2ml生理鹽水/只天，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。EAE對(duì)照組、蘇木低、中、高劑量治療組連續(xù)3天癥狀評(píng)分無加重或四肢癱瘓、死亡時(shí)作為EAE發(fā)病高峰期，處死動(dòng)物，未發(fā)病的動(dòng)物觀察2個(gè)月處死，正常對(duì)照組四周后處死動(dòng)物。觀察豚鼠發(fā)病的潛伏期、進(jìn)展期和神經(jīng)功能障礙評(píng)分；采用光鏡觀察EAE對(duì)照組及蘇木高、中、低劑量治療組豚鼠

5、腦組織病理變化；采用流式細(xì)胞儀測(cè)定正常對(duì)照組、EAE對(duì)照組及蘇木各劑量治療組高峰期外周血T細(xì)胞亞群；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定正常對(duì)照組和EAE模型組高峰期外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的水平和高峰期腦組織細(xì)胞因子IL-10含量；采用放射免疫法測(cè)定正常對(duì)照組和EAE組高峰期腦組織細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量。

6、 結(jié)果：1．豚鼠發(fā)病情況：正常對(duì)照組豚鼠無異常表現(xiàn)，EAE對(duì)照組及蘇木高、中、低劑量治療組豚鼠均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能障礙，發(fā)病豚鼠先后出現(xiàn)進(jìn)食減少、體重下降、萎糜、后肢無力、自傷后肢、后肢完全不能活動(dòng)等表現(xiàn)，嚴(yán)重者四肢癱瘓、抽搐，甚至死亡。蘇木低、中、高劑量治療組的潛伏期較EAE對(duì)照組延長(P<0.01或P<0.05)，高劑量治療組潛伏期較中、低劑量治療組延長(P<0.01)。蘇木高、中、低劑量治療組進(jìn)展期無明顯差異，但與EAE對(duì)

7、照組相比，進(jìn)展期明顯縮短(P<0.05)。蘇木高、中劑量治療組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分較EAE對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。EAE對(duì)照組、蘇木低、中、高劑量治療組死亡率依次降低，高劑量治療組死亡率為零。2．腦及脊髓病理變化：EAE對(duì)照組及蘇木高、中、低劑量治療組豚鼠的腦和脊髓都出現(xiàn)了EAE典型的病理改變：小血管周圍炎性細(xì)胞浸潤，呈袖套狀的改變，血管周圍白質(zhì)明顯的脫髓鞘改變等。蘇木各治療組脫髓鞘改變及炎性細(xì)胞浸潤較EAE對(duì)照組減輕，高

8、劑量治療組病理改變最輕，中劑量治療組較低劑量治療組減輕但比高劑量治療組明顯。3.T細(xì)胞亞群分布：EAE對(duì)照組CD4+、CD8+分布比例較正常組降低(P<0.01)，蘇木高、中、低劑量治療組CD4+、CD8+分布比例較EAE對(duì)照組高(P<0.01或P<0.05)；EAE對(duì)照組CD4+/CDs+比值較正常對(duì)照組高(P<0.01)，高、中、低劑量治療組CD4+/CD8+比值較EAE對(duì)照組降低(P<0.01)。4.細(xì)胞因子含量：EAE對(duì)照組腦組

9、織IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量較正常對(duì)照組高(P<0.05或P<0.01)，蘇木高、中、低劑量治療組腦組織IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量較EAE對(duì)照組低(P<0.05或P<0.01)，蘇木高、中劑量治療組腦組織IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量較蘇木低劑量治療組明顯增高(P<0.05)。EAE對(duì)照組腦組織IL-10含量較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，蘇木高、中、低劑量治療組腦組織IL-

10、10含量較EAE對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，蘇木高劑量治療組腦組織IL-10含量較蘇木低劑量治療組增高(P<0.05)。5.INF-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4比值：EAE對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-4的能力較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，蘇木高、中、低劑量治療組外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-4的能力較EAE對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.01)。EAE對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌INF-γ的能力較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.01

11、)，蘇木高、中、低劑量治療組外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌INF-γ的能力較EAE對(duì)照組明顯減弱(P<0.01)，蘇木中劑量治療組外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ的能力較蘇木高劑量組增強(qiáng)(P<0.05)，較蘇木低劑量治療組減弱，但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EAE對(duì)照組外周血IFN-γ/IL-4比值較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，蘇木高、中、低劑量治療組外周血IFN-γ/IL-4比值較EAE對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，蘇木高劑量治療組外周血IFN

12、-γ/IL-4比值較中、低劑量治療組低(P<0.05)。6．相關(guān)性分析：①發(fā)病高峰期外周血CD4+、CD8+分布比例與EAE對(duì)照組及蘇木各治療組發(fā)病的潛伏期呈明顯正相關(guān)，與進(jìn)展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)；發(fā)病高峰期外周血CD4+/CD8+比值與EAE對(duì)照組及蘇木各治療組發(fā)病的潛伏期呈明顯負(fù)相關(guān)，與進(jìn)展期呈明顯正相關(guān)，與EAE對(duì)照組及蘇木高、中劑量治療組神經(jīng)功能障礙評(píng)分呈明顯正相關(guān)，與蘇木低劑量治療組神經(jīng)功能障礙評(píng)分無明顯相關(guān)

13、性。②腦組織炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α)含量及外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ能力與EAE對(duì)照組及蘇木各治療組發(fā)病的潛伏期呈負(fù)相關(guān)，與進(jìn)展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分呈正相關(guān)。③外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-4能力及腦組織IL-10含量與EAE對(duì)照組及蘇木各治療組發(fā)病的潛伏期、進(jìn)展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分無明顯相關(guān)性。④外周血IFN-γ/IL-4比值與EAE對(duì)照組及蘇木各治療組發(fā)病潛伏期呈負(fù)相關(guān)，與進(jìn)展期和高峰期

14、神經(jīng)功能障礙評(píng)分呈正相關(guān)。 結(jié)論：1．通過神經(jīng)功能障礙評(píng)定、腦和脊髓病理改變證實(shí)采用CMBP皮下注射可成功建立EAE豚鼠模型。2．EAE豚鼠存在免疫功能異常，外周血T細(xì)胞亞群分布比例異常，CD4+/CD8+比值倒置，腦組織炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α)產(chǎn)生增加，抑制性細(xì)胞因子IL-10生成減少，外周血Th1/Th2失衡，Th分化向Th1漂移。其免疫功能異常與EAE豚鼠發(fā)病的潛伏期、進(jìn)展期和高峰期神經(jīng)功

15、能障礙評(píng)分密切相關(guān)。3.蘇木醇提物能延長EAE發(fā)病潛伏期、縮短EAE發(fā)病進(jìn)展期、減輕EAE豚鼠神經(jīng)功能障礙、降低高峰期死亡率，減輕EAE豚鼠病理損害，對(duì)EAE發(fā)病具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用大小與劑量呈正相關(guān)。4．蘇木醇提物可能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群異常分布、矯正CD4+/CD8+比值倒置、抑制Th1細(xì)胞活性、提高Th2細(xì)胞分泌能力、逆轉(zhuǎn)Th向Th1分化漂移、抑制炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α)產(chǎn)生、促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子