缺血后處理對(duì)缺血-再灌注損傷的修復(fù)及修復(fù)細(xì)胞來(lái)源的研究.pdf

1、目的：
　　 缺血后處理(lschemic Postconditioning，IPO)具有減輕缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)損傷的作用。其保護(hù)作用的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，不僅能阻止細(xì)胞凋亡，還參與細(xì)胞周期的調(diào)控。本課題組已經(jīng)證明IPO可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖特異性指標(biāo)5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)、磷酸化組蛋白H3(phosph-Histone H3，H3P)、Au

2、roraB的表達(dá)增加，初步證明IPO除能減少細(xì)胞凋亡外，還可以促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖補(bǔ)償受損的心肌細(xì)胞。本研究的目的是明確增殖細(xì)胞是來(lái)源于正常成熟心肌細(xì)胞還是多潛能干細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)多潛能干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物c-kit、Gata-4、Mef2C，如果c-kit、Gata-4、Mef2C測(cè)定結(jié)果陽(yáng)性，可以確定心肌組織內(nèi)多潛能干細(xì)胞的存在，如果c-kit陽(yáng)性、Gata-4、Mef2C陰性則為心肌肥大細(xì)胞。再通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)心肌橫紋肌肌動(dòng)蛋白(

3、α-sarcomeric actin，α-SMA)確定成熟心肌細(xì)胞的數(shù)量，并與多潛能干細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析，推測(cè)心肌細(xì)胞增殖的可能來(lái)源。此外，通過(guò)五個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察c-kit蛋白的表達(dá)量，觀察干細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間變化的趨勢(shì)。
　　 方法：
　　 1.分組和模型的建立。雄性SD大鼠，體重250g-300g，分為三個(gè)處理組（假手術(shù)組、I/R組和IPO組），五個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)(1d、3d、7d、14d、30d)。假手術(shù)組（S組）：將大

4、鼠開(kāi)胸左冠動(dòng)脈下穿線不結(jié)扎；缺血/再灌注組(I/R)：大鼠開(kāi)胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈30min，松開(kāi)結(jié)扎線；缺血后處理組(IPO組)：大鼠開(kāi)胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈30min后松開(kāi)結(jié)扎，再灌注1Os，再缺血1Os，連續(xù)三個(gè)循環(huán)后松開(kāi)結(jié)扎線。
　　 2、心肌細(xì)胞增殖指標(biāo)的觀察。采用普通免疫組化SABC法定位觀察細(xì)胞增殖特異性指標(biāo)5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)和橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric ac

5、tin，α-SMA)，分析心肌細(xì)胞DNA合成。
　　 3、增殖細(xì)胞來(lái)源的證明。c-kit熒光免疫標(biāo)記法定位觀察、western blot檢查其含量，RT-PCR分別檢測(cè)c-kit、Gata-4、Mef2C的表達(dá)。熒光免疫標(biāo)記法觀察α-SMA，相關(guān)性分析c-kit和α-SMA的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，確定最終細(xì)胞可能來(lái)源。
　　 4、通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，觀察IPO對(duì)受損大鼠心臟功能的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：
　　 1

6、、心肌細(xì)胞增殖的證明。免疫組化SABC法定位觀察BrdU。BrdU位于心肌細(xì)胞核，目標(biāo)蛋白染色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果顯示，棕黃色陽(yáng)性目標(biāo)蛋白顆粒在心肌組織呈散在分布，假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞較少，I/R組和IPO組陽(yáng)性細(xì)胞不同程度增多。BrdU在IPO組(PU值為：7.81±1.39);I/R組(PU值為：5.27±1.35)；假手術(shù)組(PU值為：4.39±1.22)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示IPO組的PU值與假手術(shù)組比較，有顯著性差異(P＜0.0

7、5)。IPO組與I/R組比較、I/R組與假手術(shù)組比較均在數(shù)值上有提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、增殖細(xì)胞來(lái)源的證明。
　　 2.1.c-kit的檢測(cè)
　　 熒光免疫標(biāo)記法結(jié)果顯示，在IPO組看到有c-kit陽(yáng)性細(xì)胞，尤其3天數(shù)量較多(PU值為：2.91±0.29、5.39±0.42、4.37±0.35、3.02±0.67、2.14±0.25)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)：I/R組的c-kit陽(yáng)性細(xì)胞集中

8、于7天(PU值為：1.29±0.12、2.64±0.274.71±0.59、2.85±0.27、1.71±0.38)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他處理組幾乎沒(méi)有看到c-kit陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 western blot結(jié)果進(jìn)一步確定c-kit的蛋白水平的表達(dá)量在IPO組在3d最多，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；I/R組也有相同趨勢(shì)，c-kit的蛋白表達(dá)水平在7d最多，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其它兩組

9、處理組未見(jiàn)c-kit的表達(dá)。
　　 RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IPO組和I/R組中，c-kit的表達(dá)量變化曲線與western blot基本相似，確定IPO組c-kit多潛能干細(xì)胞的表達(dá)量最大值出現(xiàn)在3d，I/R組出現(xiàn)在7d，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.2.RT-PCR檢測(cè)Gata-4和Mef2C的結(jié)果和c-kit的結(jié)果一致。
　　 2.3.干細(xì)胞和肥大細(xì)胞的區(qū)分。通過(guò)以上方法檢測(cè)多潛能干細(xì)胞表面

10、特異性標(biāo)記物c-kit、Gata-4、Mef2C均為陽(yáng)性，且表達(dá)量變化曲線基本一致，確定心肌組織內(nèi)c-kit多潛能干細(xì)胞數(shù)量存在變化，而心臟肥大細(xì)胞數(shù)量變化不影響檢測(cè)結(jié)果。
　　 2.4.心肌細(xì)胞增殖的可能來(lái)源的推測(cè)。通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)α-SMA，確定成熟心肌細(xì)胞的數(shù)量，并與多潛能干細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析，得出兩者陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化有關(guān)聯(lián)，推測(cè)心肌細(xì)胞增殖的可能來(lái)源為干細(xì)胞。
　　 3、IPO干預(yù)后可以改善大鼠心功能。

11、術(shù)后14d和30d血流動(dòng)力學(xué)的變化：I/R組和IPO組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯低于假手術(shù)組，同時(shí)LVEDP明顯高于假手術(shù)組。與I/R組比較，IPO干預(yù)后不同時(shí)間LVSP及±dp/dtmax均明顯升高(p＜0.05)，而LVEDP雖有下降趨勢(shì)，但是這種變化各組時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、IPO和I/R兩種方法都可以引起心肌組織細(xì)胞數(shù)量增加，且這種增殖的細(xì)胞可能

12、來(lái)源為c-kit陽(yáng)性的多潛能干細(xì)胞。
　　 2、IPO和I/R兩種方法引起c-kit陽(yáng)性的多潛能干細(xì)胞增殖的高峰期不同，I/R在第7d，而IPO在第3d，且IPO較I/R能更快促使c-kit陽(yáng)性的多潛能干細(xì)胞增殖。
　　 3、初步判斷c-kit陽(yáng)性的多潛能干細(xì)胞數(shù)量的改變與成熟心肌細(xì)胞的數(shù)量改變有關(guān)，即在心肌受損后c-kit陽(yáng)性的多潛能干細(xì)胞可能分化為成熟的心臟細(xì)胞以修復(fù)受損的心肌組織。
　　 4、IPO處理?yè)p傷