在低氘水誘導(dǎo)下miR-15b通過(guò)調(diào)控wee1抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖作用的研究.pdf

1、[目的]
　　1.觀察不同體積濃度的氘對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響;
　　2.探討不同體積濃度的氘對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞中miR-15b表達(dá)的誘導(dǎo)作用;
　　3.明確在肝癌HepG2細(xì)胞中miR-15b對(duì)weel靶向調(diào)控作用;
　　4.分析肝癌組織中weel的表達(dá)強(qiáng)弱與肝癌患者病例特點(diǎn)及生存時(shí)間的關(guān)系，為低氘水在肝癌臨床防治研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]
　　1.不同體積濃度的氘

2、對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;MTT法檢測(cè)不同濃度的低氘水對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖抑制作用;平板克隆比較不同濃度低氘水作用人肝癌HepG2細(xì)胞株后形成的克隆集落數(shù)的差異;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氘水對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞侵襲遷移能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)低氘水對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞周期的變化;western-blot檢測(cè)低氘水對(duì)HepG2細(xì)胞的weel、mytl、cyclinbl、cyclinA、phospho-cdc2、p21、p

3、hospho-histone H3蛋白表達(dá)情況。
　　2.不同濃度的氘對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞中miR-15b表達(dá)誘導(dǎo)作用，AffymetrixmicroRNA芯片分析低氘水處理肝癌HepG2細(xì)胞后的miRNA差異表達(dá)譜;QPCR驗(yàn)證低氘水對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的miR-15b差異表達(dá)。
　　3.肝癌HepG2細(xì)胞中miR-15b對(duì)weel的靶向調(diào)控作用;生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因及其功能;雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-let7b靶向調(diào)控

4、weel; RT-PCR檢測(cè)miR-15b inhibitor和mimics轉(zhuǎn)染肝癌HepG2后weel的mRNA的表達(dá)變化;Western-blot檢測(cè)miR-15b inhibitor和mimics轉(zhuǎn)染肝癌HepG2后weel的蛋白表達(dá)變化。
　　4.HepG2細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b后對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;MTT法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b后對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖抑制作用;平板克隆比較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b

5、后肝癌HepG2細(xì)胞株后形成的克隆集落數(shù)的差異;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b后肝癌HepG2細(xì)胞侵襲遷移能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b后肝癌HepG2細(xì)胞周期的變化;western-blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b后HepG2細(xì)胞的weel、mytl、cyclinb1、cyclinA、cyclinE、phospho-cdc2、p21、phospho-histone H3分子表達(dá)情況。
　　5.肝癌組織中抗凋亡蛋

6、白Bcl-2的表達(dá)強(qiáng)弱與肝癌患者病例特點(diǎn)的關(guān)系;免疫組化檢測(cè)100例肝癌組織切片中weel蛋白表達(dá)強(qiáng)弱差異，以及與肝癌患者病例特點(diǎn)的相關(guān)性。
　　[結(jié)果]
　　l.不同體積濃度的氘對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。隨著培養(yǎng)基中氘含量下降，肝癌HepG2細(xì)胞增殖顯著被抑制(P＜0.05)，克隆生成和游走侵襲能力顯著下降(P＜0.01)，;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，低氘水能誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯:S期減少，

7、G1、G2期顯著增加(P＜0.05); Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示低氘水能引起weel、mytl、cyclinbl、cyclinA、phospho-cdc2、phospho-histone H3蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)， p21蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。
　　2.不同體積濃度的氘對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞中miR-15b表達(dá)誘導(dǎo)作用。Affymetrix microRNA芯片比較低氘水(50ppm)與普通水(150ppm)培養(yǎng)肝癌H

8、epG2細(xì)胞后，miRNA表達(dá)譜差異結(jié)果顯示差異倍數(shù)在兩倍以上的miRNA有182個(gè)，其中96個(gè)高表達(dá)，86個(gè)低表達(dá);QPCR驗(yàn)證低氘水對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的miRNA差異表達(dá)譜中miR-15b升高(P＜0.01）。
　　3.肝癌HepG2細(xì)胞中miR-15b對(duì)weel的靶向調(diào)控作用。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:hsa-miR-15b調(diào)控weel基因的表達(dá)，被調(diào)控的靶基因與腫瘤的周期、增殖等相關(guān);雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:weel是mi

9、R-let-7b的靶向調(diào)控基因(P＜0.05); miR-15b轉(zhuǎn)染后RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明:weel是hsa-miR-15b調(diào)控的靶基因。肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-15b minics后蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-15b inhibitor后weel蛋白表達(dá)明顯增加，而對(duì)weel mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響。結(jié)果顯示:miR-15b可在翻譯水平調(diào)控靶蛋白表達(dá);
　　4.HepG2細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)

10、染miR-15b后對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b后能明顯抑制人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖（P＜0.05），克隆生成和游走侵襲能力顯著下降(P＜0.01）;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b后能誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯:S期減少，G1、G2期顯著增加(P＜0.05);Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-15b后能引起weel、mytl、cyclinbl、cyclinA、cyclinA

11、 E、phospho-cdc2、蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)， p21和phospho-histone H3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。
　　5.肝癌組織中weel蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱與肝癌患者病例特點(diǎn)的關(guān)系。根據(jù)對(duì)100例肝癌標(biāo)本免疫組化實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析:患者肝癌組織中wee1蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱與患者的腫瘤分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);沒(méi)有檢測(cè)到與其它病理特點(diǎn)如性別、年齡和腫瘤分級(jí)等因素的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　[結(jié)論]