DLC-1在垂體腺瘤中的表達(dá)與侵襲性的關(guān)系及其啟動(dòng)子甲基化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、垂體腺瘤約占顱內(nèi)腫瘤的10％～15％，盡管它是良性腫瘤，但是仍然可以導(dǎo)致臨床癥狀。占位效應(yīng)可以導(dǎo)致頭痛、視力下降；功能性垂體腺瘤可以引起激素分泌失調(diào)，能導(dǎo)致情緒障礙、性功能障礙、不育、肥胖、高血壓、糖尿病，加速心臟疾病惡化；殘余的距常垂體組織受壓會(huì)出現(xiàn)垂體功能低下。垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展涉及諸多因素：基因突變與失活、下丘腦激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等。垂體腺瘤中可見(jiàn)基因突變、缺失、重組，而異常甲基化致腫瘤抑制基因沉默也是垂體腺瘤發(fā)生的一個(gè)重要

2、機(jī)制。越來(lái)越多的證據(jù)表明垂體腺瘤是單克隆發(fā)生并且伴隨基因改變，然而我們對(duì)于垂體瘤發(fā)生發(fā)展伴隨的基因改變?nèi)匀凰跎佟?br>　　 為了研究垂體瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，本課題組前期使用Affymetrix公司U133 Plus2.0基因芯片研究人侵襲性、非侵襲性垂體瘤和人正常垂體之間的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)一系列下調(diào)基因，其中包括DLC-1。1998年，Yuan等在對(duì)多個(gè)肝癌細(xì)胞系的8號(hào)染色體的研究中，用再現(xiàn)差異分析法(RDA)，發(fā)現(xiàn)一種重要抑癌基

3、因DLC-1?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在許多原發(fā)腫瘤和細(xì)胞系中DLC-1均出現(xiàn)低表達(dá)或表達(dá)缺失，但在人體各正常組織中均表達(dá)；在多種原發(fā)腫瘤和細(xì)胞系中還發(fā)現(xiàn)了DLC-1基因發(fā)生啟動(dòng)子甲基化。DLC-1含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：RhoGAP、SAM和START。研究表明DLC-1能調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架形成和形態(tài)改變，影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、增殖、遷移和凋亡。
　　 為探討DLC-1基因在垂體腺瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題探討了垂體腺瘤中DLC-1不同轉(zhuǎn)錄本mRNA的表達(dá)、蛋白表

4、達(dá)與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系，并對(duì)DLC-1啟動(dòng)子甲基化進(jìn)行了研究；初步探討DLC-1基因在垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的作用。本論文從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究：1.人垂體腺瘤中DLC-1不同轉(zhuǎn)錄本mRNA的表達(dá)和垂體腺瘤侵襲性關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究；2.人垂體腺瘤中DLC-1的蛋白表達(dá)和垂體腺瘤臨床病理相關(guān)性分析的實(shí)驗(yàn)研究；3.人垂體腺瘤中DLC-1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的研究。
　　 第一部分人垂體腺瘤中DLC-1不同轉(zhuǎn)錄本mRNA的表達(dá)和垂體

5、腺瘤侵襲性關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：明確DLC-1三個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本mRNA在正常垂體和各類(lèi)型垂體腺瘤組織中的表達(dá)情況及其同垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系。
　　 方法：設(shè)計(jì)各轉(zhuǎn)錄本特異性引物，運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，檢測(cè)DLC-1不同轉(zhuǎn)錄本mRNA在正常垂體和各類(lèi)型垂體腺瘤組織中的表達(dá)。垂體腺瘤標(biāo)本按臨床表現(xiàn)和磁共振特征分為侵襲組和非侵襲組，按臨床表現(xiàn)和免疫組化分為功能性腺瘤組和無(wú)功能腺瘤組。分析不同轉(zhuǎn)錄本在各組表現(xiàn)情況。<

6、br>　　 結(jié)果：1.DLC-1轉(zhuǎn)錄本一、二在正常垂體及垂體腺瘤中均有表達(dá)；未見(jiàn)有第三轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。2.正常垂體中DLC-1轉(zhuǎn)錄本一、二的mRNA表達(dá)水平顯著高于垂體腺瘤組(P＜0.01);侵襲組中DLC-1轉(zhuǎn)錄本一、二的mRNA表達(dá)水平顯著低于非侵襲組(P＜0.01)，功能性腺瘤組與無(wú)功能腺瘤組表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：DLC-1轉(zhuǎn)錄本一、二在正常垂體及垂體腺瘤中均有表達(dá)，與垂體腺瘤侵襲性關(guān)系密切；未見(jiàn)有

7、第三轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。
　　 第二部分人垂體腺瘤中DLC-1的蛋白表達(dá)和垂體腺瘤臨床病理相關(guān)性分析的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：明確DLC-1、Ki-67蛋白在各類(lèi)型垂體腺瘤組織及正常垂體中的表達(dá)及其同垂體腺瘤臨床病理的關(guān)系，探討DLC-1和Ki-67的相關(guān)性。
　　 方法：垂體腺瘤標(biāo)本按臨床表現(xiàn)和磁共振特征分為侵襲組和非侵襲組，按臨床和免疫組化分為功能性腺瘤組和無(wú)功能腺瘤組。運(yùn)用免疫組化技術(shù)觀察DLC-1和Ki-67蛋白的

8、細(xì)胞表達(dá)定位，以及在不同組別的表達(dá)差異，討論二者表達(dá)的相關(guān)性；運(yùn)用western-blot方法檢測(cè)標(biāo)本中DLC-1的蛋白表達(dá)，觀察其與垂體腺瘤侵襲性關(guān)系。
　　 結(jié)果：1.DLC-1蛋白表達(dá)定位于垂體腺瘤及正常垂體細(xì)胞漿；Ki-67蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核。2.正常垂體中DLC-1蛋白表達(dá)水平顯著高于垂體腺瘤組(P＜0.01)；侵襲組中DLC-1蛋白表達(dá)水平顯著低于非侵襲組(P＜0.01)，功能性腺瘤組和無(wú)功能腺瘤組無(wú)明顯差異(P＞

9、0.05)；3.垂體腺瘤中Ki-67蛋白表達(dá)水平顯著高于正常垂體組(P＜0.01)；侵襲組Ki-67蛋白表達(dá)水平顯著高于非侵襲組(P＜0.01)，功能性腺瘤組和無(wú)功能腺瘤組無(wú)顯著差異(P＞0.05)；4.垂體腺瘤中DLC-1和Ki-67的蛋白表達(dá)有負(fù)相關(guān)性(r=-0.764，P＜0.01)。
　　 結(jié)論：DLC-1表達(dá)下調(diào)可能和垂體腺瘤的發(fā)生、侵襲性及增殖能力改變有關(guān)。
　　 第三部分人垂體腺瘤中DLC-1啟動(dòng)子甲基化狀

10、態(tài)的研究
　　 目的：明確人垂體腺瘤中DLC-1低表達(dá)是否由于基因啟動(dòng)子甲基化引起。
　　 方法：設(shè)計(jì)DLC-1基因甲基化、非甲基化引物，運(yùn)用MSP(methylation-specificPCR，甲基化特異性PCR)方法檢測(cè)人垂體腺瘤細(xì)胞中DLC-1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：所有垂體腺瘤標(biāo)本非甲基化引物都能擴(kuò)增，而僅有2例(2/15)標(biāo)本甲基化引物能擴(kuò)增：甲基化、非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)