缺血后處理啟動(dòng)細(xì)胞周期促進(jìn)受損心肌組織修復(fù)的研究.pdf

1、目的：缺血后處理(IschemiaPostconditioning,IPO)作為一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，已經(jīng)證明可以有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡，但是否還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，修復(fù)受損的心肌組織尚不清楚。本研究通過建立大鼠缺血后處理模型，觀察細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67、H3P和細(xì)胞周期蛋白cyclins和CDKs的變化，研究IPO能否通過啟動(dòng)細(xì)胞周期，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而補(bǔ)償受損心肌組織。
　　方法：
　　1、模型的建立。健康成年雄性8

2、周齡(220±25g)SD大鼠，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Shamoperation,Sham)、缺血再灌注組(Ischemia/Reperfusion,I/R)、缺血后處理組(IschemicPostconditioning,IPO)。分別于術(shù)后1天、3天、7天和14天檢測相關(guān)指標(biāo)。
　　2、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測定。分別記錄術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：左室舒張末期壓(LVEDP)、左室收縮壓(LVSP)、左室等容期上升最大速率(+d

3、p/dtmax)和左室等容期下降最大速率(-dp/dtmax)。
　　3、心肌組織細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67和H3P的檢測。分別采用免疫組化SABC法和免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Ki67和H3P的表達(dá)情況，并隨機(jī)選取十個(gè)視野進(jìn)行陽性單位和陽性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)。
　　4、心肌組織細(xì)胞周期cyclins和CDKs的檢測。
　　(1)mRNA水平運(yùn)用RT-PCR法檢測術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期蛋白(cyclinA、B、D、E)和細(xì)胞

4、周期蛋白依賴性激酶(CDK1、2、4、6)的表達(dá)，并進(jìn)行灰度比值分析；
　　(2)蛋白水平運(yùn)用WesternBlot法檢測術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)水平，并進(jìn)行灰度比值分析；
　　(3)組織水平運(yùn)用免疫組化SABC法和免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)，并隨機(jī)選取十個(gè)視野進(jìn)行陽性單位和陽性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果：
　　1、模型的建立。缺血過程中ST段

5、抬高，表明缺血成功；當(dāng)血液恢復(fù)再灌，ST段恢復(fù)至正常。
　　2、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)IPO、I/R組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯低于Sham組(P<0.05)，同時(shí)LVEDP明顯高于Sham組(P<0.05)。與I/R組比較，IPO干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)LVSP及±dp/dtmax均升高(P<0.05)，而LVEDP有下降趨勢。
　　3、心肌細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67和H3P的檢測結(jié)果。
　　

6、(1)免疫組化SABC法檢測Ki67、H3P的表達(dá)結(jié)果：在心肌組織中散在分布，染色呈棕色的為陽性細(xì)胞。Sham組陽性細(xì)胞極少，IPO組和I/R組陽性細(xì)胞在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的增多。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與Sham組比較，IPO組陽性單位顯著增多具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，并且觀察到正在分裂的心肌細(xì)胞。與I/R組比較，IPO組Ki67陽性單位在術(shù)后第3天和7天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而H3P在術(shù)后第3天具有統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)差異(P<0.05)。
　　(2)免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測Ki67、H3P的表達(dá)結(jié)果：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)IPO組陽性細(xì)胞數(shù)與Sham組比較，在術(shù)后第1天、3天和7天有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；術(shù)后第3天、7天IPO組和I/R組比較也具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，可能與免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測靈敏度高有關(guān)。
　　4、心肌組織細(xì)胞周期cyclins和CDKs的檢測結(jié)果。
　　(1)mRNA水平檢測cyclinA、B、

8、D、E和CDK1、2、4、6的表達(dá)結(jié)果：
　　cyclinA2和cyclinB：IPO組和I/R組cyclinA2和cyclinB表達(dá)水平在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于Sham組(P<0.05)，且分別在術(shù)后3天和7天達(dá)到峰值。
　　cyclinD：與Sham組比較，I/R組cyclinD表達(dá)水平在術(shù)后1天和7天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而IPO組cyclinD表達(dá)量分別在術(shù)后1天，3天和7天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05

9、)。與I/R組比較，IPO組在術(shù)后第3天表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　cyclinE：與Sham組比較，IPO組cyclinE表達(dá)水平分別在術(shù)后1天，3天和7天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。組間比較，IPO組和I/R組cyclinE表達(dá)水平分別在術(shù)后3天，7天和14天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　CDK1：與Sham組比較，IPO組和I/R組CDK1表達(dá)水平在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

10、<0.05)。組間比較，術(shù)后3天和7天有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　CDK2：與Sham組比較，I/R組CDK2表達(dá)水平在術(shù)后3天和7天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而IPO組CDK2表達(dá)水平分別在術(shù)后1天，3天和7天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　CDK4和CDK6表達(dá)量各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　(2)蛋白水平檢測cyclinA2和cyclinB的表達(dá)結(jié)果。
　　cyclinA2

11、和cyclinB在Sham組幾乎沒有表達(dá)。IPO和I/R組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均有顯著增加(P<0.05)。IPO與I/R組比較，cyclinA2表達(dá)水平在術(shù)后1天，3天和7天均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。cyclinB結(jié)果與之相同。
　　(3)組織水平檢測cyclinA2和cyclinB的表達(dá)結(jié)果
　　免疫組化SABC法檢測cyclinA2和cyclinB的表達(dá)結(jié)果：Sham組cyclinA2、cyclinB陽性細(xì)胞數(shù)

12、很少，IPO組和I/R組陽性細(xì)胞明顯增多。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：cyclinA2IPO組陽性單位在術(shù)后第1天、3天和7天顯著大于Sham組，且在術(shù)后3天與I/R組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；cyclinBIPO組陽性單位在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)顯著大于Sham組，且在術(shù)后第1天、3天和7天與I/R組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測cyclinA2和cyclinB的表達(dá)結(jié)果：cyclinA2術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Sham組

13、cyclinA2陽性細(xì)胞數(shù)顯著少于IPO組和I/R組(P<0.05)。組間比較，術(shù)后1天，3天和7天陽性細(xì)胞數(shù)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且IPO組陽性細(xì)胞數(shù)在3天達(dá)到峰值(P<0.05)；cyclinB術(shù)后第1天、3天和7天IPO組陽性細(xì)胞數(shù)顯著大于Sham組(P<0.05)。組間比較，術(shù)后3天和7天陽性細(xì)胞數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且IPO組陽性細(xì)胞數(shù)在3天達(dá)到峰值(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、IPO可有效改善心功能。