兔同種異體脫鈣骨復合骨髓間充質(zhì)干細胞關節(jié)腔內(nèi)培養(yǎng)軟骨與同腔軟骨的性狀對比研究.pdf

1、目的采用兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)復合同種異體脫鈣骨(DBM)體外培養(yǎng)和關節(jié)腔內(nèi)培養(yǎng)組織工程軟骨與同腔軟骨的性狀對比研究。
　　方法1.采用同源雄性新西蘭幼兔(4~6周齡)全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)原代BMSC,第三代細胞融合至約80％時培養(yǎng)基中加入成軟骨誘導液:含轉化生長因子(TransformingGrowthFactor,TGF)-β110ng/ml、胰島素樣生長因子(Insulin-likeGrowthFactor,IGF)

2、-120ng/ml、維生素C50ng/ml。2.根據(jù)Urist提供的方法制作DBM并做掃描電鏡(SEM)觀察。3.將誘導后的BMSC種植于30個DBM支架培養(yǎng)并分別在體外(A組)及關節(jié)腔內(nèi)(B組)培養(yǎng)。于4、8、12周分別取材,同時取同腔軟骨(C組)作為對照,行SEM等大體形態(tài)觀察并制石蠟切片行蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-EosinStaining,HE)、甲苯胺藍(ToluidineBlue,TB)染色、Masson三色

3、染色、Ⅱ型膠原免疫組化等組織學觀察并進行比較。
　　結果1.本實驗方法分離和培養(yǎng)的BMSC形態(tài)特征明顯,呈長梭形,原代培養(yǎng)10~12天細胞融合約90%,增殖傳代的細胞6~7天可達約90%融合。2.BMSC經(jīng)定向誘導后表現(xiàn)出軟骨細胞的特性。3.制備得到的DBM為三維立體疏松多孔的海綿樣結構。4.A、B、C三組培養(yǎng)12w后,取出標本行SEM等大體觀察、組織學切片觀察及Ⅱ型膠原免疫組化檢測:A組:SEM:標本表面凹凸不平,內(nèi)部尚有部分空

4、隙;HE染色見軟骨細胞少量增生,胞核藍染;甲苯胺藍染色見軟骨細胞排列無序,少量周圍基質(zhì)包繞;Masson染色陽性區(qū)域小,細胞排列無序;Ⅱ型膠原免疫組化見軟骨細胞胞漿及胞外基質(zhì)少量黃色顆粒。B組:SEM:標本表面較光滑;HE染色見軟骨細胞增生,胞核藍染;甲苯胺藍染色見軟骨細胞成串排列,軟骨陷窩形成,周圍基質(zhì)包繞;Masson染色陽性,軟骨細胞多,基質(zhì)藍染,按一定應力方向排列;Ⅱ型膠原免疫組化見細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)較多棕黃色顆粒,Ⅱ型膠原染色陽