DEGS1抑制食管癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移及其相關(guān)機制研究.pdf

1、退行性精母細(xì)胞同系物1(DEGS1)最初是以表皮生長因子受體(EGFR)分子為“誘餌”通過酵母雙雜交方法而篩選出來。我們首先通過免疫共沉淀(Co-IP)實驗和pulldown實驗證明DEGS1能與EGFR相互作用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實驗進(jìn)一步證明顯示DEGS1在細(xì)胞內(nèi)與EGFR有直接的相互作用。由于DEGS1與EGFR在細(xì)胞內(nèi)、外都能發(fā)生相互作用，我們將這兩個分子共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞以驗證DEGS1是否會影響EGFR的表達(dá)

2、？共轉(zhuǎn)染的實驗結(jié)果顯示，DEGS1的表達(dá)能抑制EGFR的蛋白表達(dá)而不影響其mRNA水平。這一點提示我們，DEGS1對EGFR的表達(dá)抑制不是在轉(zhuǎn)錄水平而是在翻譯或翻譯后的修飾方面。EGFR蛋白翻譯后修飾的主要特點是蛋白表達(dá)后的泛素化過程。EGFR蛋白經(jīng)過泛素化修飾后被運送至蛋白酶體進(jìn)行降解。隨后的泛素化實驗證明，DEGS1的存在顯著促進(jìn)了EGFR蛋白的泛素化過程而與EGFR的磷酸化修飾無關(guān)。至此，我們了解到DEGS1能與EGFR相互作用并

3、通過增加EGFR的泛素化程度而促進(jìn)EGFR的降解，從而影響EGFR的蛋白水平。 EGFR及其家族成員與腫瘤的關(guān)系密切，它們的表達(dá)影響著腫瘤病人的臨床癥狀.EGFR在食管癌中有100％的高表達(dá)。而我們的實驗證明，DEGS1能抑制EGFR的表達(dá)。于是我們想了解食管癌細(xì)胞中DEGS1與EGFR的表達(dá)模式及相互關(guān)系。我們檢測了7株食管癌細(xì)胞系細(xì)胞，7株食管癌細(xì)胞系中EGFR的表達(dá)與DEGS1的表達(dá)呈反比例對應(yīng)。即EGFR表達(dá)相對較高的細(xì)

4、胞株其DEGS1表達(dá)相對較低，而EGFR表達(dá)相對較低的細(xì)胞株，其DEGS1表達(dá)相對則較高。為了更加深入地研究DEGS1與食管癌的關(guān)系，我們選擇食管癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步地研究。我們構(gòu)建了DEGS1過表達(dá)的Eca109細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株，并運用慢病毒載體(Lentivirus)對本底的DEGS1水平進(jìn)行RNA干涉。與對照細(xì)胞相比，DEGS1過表達(dá)Eca109細(xì)胞的體外生長能力、體外克隆形成能力、細(xì)胞遷移能力下降，DEGS1的表達(dá)也

5、抑制了Eca109細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的能力。相反，SiRNA下調(diào)DEGS1的表達(dá)后，Eca109細(xì)胞的體外生長能力、克隆形成能力、細(xì)胞遷移能力以及體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移能力反而增強。這些實驗證明，DEGS1在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)影響了食管癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長、增殖和遷移的能力。 為了進(jìn)一步闡明DEGS1抑制食管癌細(xì)胞生長、增殖及遷移的作用機制，我們首先檢測了DEGS1對食管癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響。我們將特異的DEGS1小分子RNA

6、(SiRNA)克隆至慢病毒載體，293T中包裝為成熟病毒后分別感染4株食管癌細(xì)胞Eca109、Caes17、KYSE-150和TE-12。用流式細(xì)胞儀對處與不同細(xì)胞周期的細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)。DEGS1SiRNA下調(diào)DEGS1的表達(dá)水平后，細(xì)胞周期中處于不同時期的細(xì)胞數(shù)目有所改變。與對照細(xì)胞相比，SiRNA下調(diào)DEGS1水平后的細(xì)胞處于S期的數(shù)目明顯增多，其所占比例達(dá)到70％左右，而對照細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞只有50％左右。另一方面，SiRNA下

7、調(diào)DEGS1水平后的細(xì)胞處于G0/G1期的比例為10％左右，比對照細(xì)胞的30％左右要少。 另外，由于腫瘤的細(xì)胞的凋亡也會影響到它們的生長和增殖能力，我們也對DEGS1過表達(dá)的Eca109細(xì)胞及其對照細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了檢測。AnnexinV/PI雙染后，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，DEGS1過表達(dá)細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的比例增多。由此可見，DEGS1的表達(dá)加速了食管癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞的凋亡。更重要的是，接下來的實驗證明，DEGS1的

8、表達(dá)誘導(dǎo)了半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族中的Caspase-6分子的表達(dá)。將DEGS1分子轉(zhuǎn)染至食管癌Eca109細(xì)胞，Westernblotting檢測幾個Caspase家族的分子的蛋白水平后發(fā)現(xiàn)，在相繼的幾個時間點上，只有Caspase-6分子的蛋白水平升高，而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8的蛋白表達(dá)沒有變化。RT-PCR檢測DEGS1過表達(dá)Eca109細(xì)胞、DEGS1SiRNAEca109細(xì)胞及其

9、對照細(xì)胞的mRNA水平發(fā)現(xiàn)，DEGS1過表達(dá)Eca109細(xì)胞中的Caspase-6mRNA水平比對照細(xì)胞高。相反，DEGS1SiRNAEca109細(xì)胞中Caspase-6的mRNA水平則比對照細(xì)胞低。這些實驗證明，DEGS1的表達(dá)能誘導(dǎo)凋亡相關(guān)的Caspase-6分子的mRNA和蛋白的表達(dá)。由于DEGS1過表達(dá)細(xì)胞中Caspase-6的蛋白和mRNA水平升高，我們用一個特別的報告基因系統(tǒng)來檢測DEGS1對Caspase-6轉(zhuǎn)錄活性的影響

10、。該系統(tǒng)將Caspase-6基因的啟動子(promoter)克隆至含luciferase報告基因質(zhì)粒pGL3-Basic的前端。 在Capase-6啟動子的前端分別克隆一段含CD1、CRE和NF-kappaB結(jié)合位點或CD1結(jié)合位點缺失或CRE、NF-kappaB結(jié)合位點點突變的前導(dǎo)序列。實驗證明，DEGS1的表達(dá)促進(jìn)了Caspase-6的轉(zhuǎn)錄活性而且這中促進(jìn)作用是通過NF-kappaB途徑來進(jìn)行的。因為NF-kappaB結(jié)合位

11、點的突變導(dǎo)致相對轉(zhuǎn)錄活性的下降。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)之前必須經(jīng)過一個活化的階段。這個活化過程包括IKK信號復(fù)合體的活化、NF-κB的抑制子IκB的磷酸化。接下來的實驗顯示，當(dāng)NF-κB的活化被抑制時，DEGS1對Caspase-6轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)也受到抑制。這說明NF-κB的活化是DEGS1促進(jìn)Caspase-6轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)Caspase-6表達(dá)所必需的條件之一。 綜上所述，在本課題研究中我們首次報道： 1、DEGS1分子