薄層色譜生物自顯影新方法的建立及荷葉堿衍生物抗乙酰膽堿酯酶活性評(píng)價(jià).pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，是一種多發(fā)于老年人，以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前為止，對(duì)于AD發(fā)病機(jī)理主要以膽堿能假說(shuō)和β-淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)為主。根據(jù)學(xué)說(shuō)，抑制AD病人乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)的活力，延長(zhǎng)腦內(nèi)乙酰膽堿的存在時(shí)間，使乙酰膽堿在腦內(nèi)的含量增加，成為當(dāng)前治療AD有效的手段之一。因此，乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetylchol

2、inesterase inhibitor，AChEI)被廣泛的應(yīng)用于AD的治療，并取得一定效果。但現(xiàn)在的治療藥物只能延緩AD患者的病情加深，不能完全治愈，并且還存在藥物具有副作用、活性不高、選擇性低等方面的不足。為了尋找新的更高效的AChEI，本論文進(jìn)行了以下的兩方面研究。
　　 其一，用于檢測(cè)植物提取物中乙酰膽堿酯酶抑制劑的薄層色譜生物自顯影新方法的建立迄今為止，薄層色譜(TLC)生物自顯影技術(shù)和Ellman方法是檢測(cè)AChE

3、I較常用的實(shí)驗(yàn)方法。前者優(yōu)勢(shì)在于可以同時(shí)從植物提取物中檢測(cè)并分離有AChE抑制活性的化合物。而后者主要針對(duì)實(shí)驗(yàn)室合成的或分離得到的天然的化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。但現(xiàn)有的TLC自顯影方法酶消耗量大(6U/mL)，實(shí)驗(yàn)成本較高，從而阻礙了經(jīng)費(fèi)不足的實(shí)驗(yàn)中心的研究工作。因此，建立一種酶的用量低、檢測(cè)線(xiàn)低的新型TLC生物自顯影方法，是非常必要的。
　　 本文首先利用乙?；姆椒ǎ铣闪?2種新的乙酰膽堿酯酶底物（乙酸酯衍生物），然后利用H

4、PLC技術(shù)對(duì)于每個(gè)化合物的酶水解情況進(jìn)行測(cè)定，篩選得到了5種酶水解效果較好的底物（水解率＞50％）接著分別以重氮化聯(lián)苯胺、重氮化-4-硝基苯胺、鐵氰化鉀-氯化鐵和羥基胺-氯化鐵為顯色劑，來(lái)構(gòu)建新的薄層色譜生物自顯影技術(shù)。結(jié)果顯示只有以4-甲氧基醋酸苯酯(14)作為底物，鐵氰化鉀和七水合氯化鐵混合溶液做為顯色劑時(shí)，成功建立了新型薄層色譜生物自顯影方法。該方法中酶的消耗量大大降低(1U/mL)，兩種陽(yáng)性藥石杉?jí)A甲和毒扁豆堿的檢測(cè)線(xiàn)也較低（分

5、別為0.1ng和1ng）。
　　 新方法的優(yōu)點(diǎn)在于不但降低酶的用量，而且背景與抑制劑斑點(diǎn)反差較大，容易觀(guān)察，使得尋找新型AChEI更加便捷。
　　 其二，荷葉堿衍生物的合成及抗乙酰膽堿酯酶活性評(píng)價(jià)。
　　 本研究小組在前期研究工作中，從荷葉中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)荷葉堿衍生物（2-羥基-1-甲氧基阿樸啡，2-hydroxy-1-methoxyaporphine，化合物34），其具有高的乙酰膽堿酯酶抑制活性(IC50=1.5μ

6、g/mL)。本文對(duì)荷葉堿(Nuciferine)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，并研究了其構(gòu)效關(guān)系，具體如下：
　　 (1)以荷葉堿為原料，通過(guò)O-脫烷基化、N-脫烷基化和芳構(gòu)化等反應(yīng)，合成出8種荷葉堿衍生物，它們分別是1-羥基-2-甲氧基阿樸啡(24)、1，2-二羥基阿樸啡(25)、6-羥基去氫荷葉堿(26)、荷葉堿-N-氧化物(27)、去氫荷葉堿(28)、原荷葉堿(29)、1-羥基-2-甲氧基-N-降阿樸啡(30)和1，2-二羥基-N-降阿

7、樸啡(31)。
　　 (2)利用改進(jìn)的Ellman方法，對(duì)各化合物在終濃度為0.1mg/mL的條件下，進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果表明1，2-二羥基阿樸啡(25)和去氫荷葉堿(28)具有中等AChE抑制活性，IC50分別為28μg/mL和25μg/mL。
　　 (3)比較構(gòu)效關(guān)系后發(fā)現(xiàn)荷葉堿的C環(huán)芳構(gòu)化及C-1烷氧基、C-2位羥基、氮上烷基取代基的變化對(duì)化合物活性影響較大。
　　 以上研究，為今后由荷葉堿合成更高活性的乙酰