Mic和Amic的冠突偽尾柱蟲的差異表達基因的克隆和功能研究.pdf

1、纖毛蟲大核和小核的分化，正如高等動物有體細胞和生殖細胞分化一樣，二者在本質(zhì)上十分相似。近二十年來，本實驗室對多種腹毛類纖毛蟲有小核細胞(Micronucleates，Mic)和無小核細胞(Amicronucleates，Amic)的比較研究證明，它們的小核都具有明顯的體功能，盡管其表現(xiàn)形式不盡相同。這些研究結果無疑突破了傳統(tǒng)的大、小核分工理念，為小核的體功能積累了大量細胞學證據(jù)。那么，小核體功能的遺傳機理是什么?兩種細胞系不同生長、發(fā)育

2、階段的基因表達譜有何差異?相關差異表達基因的結構與功能如何?帶著這些問題，在詳細綜述國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和前人工作的基礎上，本論文從細胞學和分子遺傳學兩個方面分四部分展開了研究。 第一部分、對冠突偽尾柱蟲Mic細胞和Amic進行了細胞學研究。采用橫向切割方法建立多個Amic細胞系，通過蛋白銀染色技術和激光共聚焦技術驗證了Amic細胞AZM缺損的表型與獲得Amic細胞系的切割方法無關。同時，前人關于“AZM小膜結構缺損產(chǎn)生于分裂間期，

3、但通過新一輪的形態(tài)發(fā)生，其AZM又能得到恢復”的結論被再次獲得證實。放線菌素D是基因轉錄的抑制劑，用其處理冠突偽尾柱蟲Amic間期細胞，能大大降低AZM的缺損率。據(jù)此推測，Amic細胞AZM結構的不穩(wěn)定性很可能與兩種細胞系間存在基因表達差異有關。 第二部分、對冠突偽尾柱蟲Mic細胞系和Amic細胞系在無性繁殖周期的三個應激條件下的差異表達基因進行了克隆和鑒定。利用抑制性消減雜交技術(SSH)構建三個正向消減文庫和一個反向消減文庫

4、，對其中1030個克隆進行了篩選，對所得107個陽性克隆進行了序列分析，共獲得65個可能參與纖毛蟲細胞分化與發(fā)育、信號轉導、轉錄、細胞周期調(diào)控、脅迫應答和細胞結構相關的EST。同時，利用實時半定量熒光PCR對代表性陽性克隆在兩細胞系的表達差異進行了相對定量分析。結果表明：Mic細胞系和Amic細胞系在相同的應激條件下呈現(xiàn)明顯的表達差異，序列分析的結果暗示：小核的失去可能導致細胞鈣信號轉導紊亂，細胞脅迫響應能力下降，為第一部分的細胞形態(tài)學

5、研究結果提供了分子遺傳機理方面的佐證。 第三部分、在前人細胞學觀察的基礎上，對冠突偽尾柱蟲Mic細胞系和Amic細胞系在接合生殖階段差異表達的基因進行了克隆和鑒定。利用SSH技術構建了一個正向消減文庫，對其中80個克隆進行了篩選，對32個陽性克隆進行了序列分析，共鑒定出23個差異表達的EST，它們分別與RNA干涉、DNA復制與修復、細胞信號轉導、基因表達與調(diào)控以及脅迫應答有關。同時，利用實時半定量熒光PCR對8個代表性陽性克隆在

6、Mic×Mic與Amic×Amic兩種交配組合的表達差異進行了相對定量分析。結果表明，Mic×Mic與Amic×Amic兩種交配組合在第一次皮膜改組之前存在明顯的基因表達差異。據(jù)此本文提出假設，認為Amic×Amic第一次形態(tài)發(fā)生事件出現(xiàn)異常與失去小核進而引發(fā)一系列基因表達負調(diào)控因子的喪失有關。 第四部分、利用RACE技術和Mac-end-Mac技術對兩種細胞系有性和無性生活周期中代表性差異表達基因的全長進行了克隆和功能分析。

7、 1.克隆了在無性生活周期存在明顯表達差異的Y180的全長大核基因和cDNA。生物信息學分析提示，這一新基因可能在細胞生長、胞外分泌及細胞信號轉導方面具有重要功能。利用RNAi喂飼技術對該基因的功能進行初步鑒定表明，其mRNA表達受到抑制后，細胞皮層結構發(fā)生錯誤排列，大核在整個細胞質(zhì)的空間位置，數(shù)目和形態(tài)發(fā)生明顯變化。 2.克隆了HSP70和HSP90全長大核基因以及HSP90全長cDNA序列。生物學信息學分析表明，所克隆

8、的HSP90定位于細胞質(zhì)，HSP70定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。間接免疫熒光技術觀察表明，HSP70參與了冠突偽尾柱蟲纖毛器和其它微管胞器的構成。通過高溫誘導HSP70和HSP90表達，Amic細胞培養(yǎng)群體中口器缺損率明顯下降。結合前人的相關研究結果，本文提出假設認為，HSP70可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和微管修復機制參與Amic細胞缺損口器的修復。 3.克隆了Mic細胞系有性生活周期上調(diào)表達幅度最大的PPD的全長大核基因，并利用RNAi喂飼技術驗證