聚磷酸鹽激酶1在腦膜炎大腸桿菌K1株致病中的相關功能研究.pdf

1、大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)K1株是引發(fā)新生兒腦膜炎最常見的革蘭陰性桿菌。盡管抗生素和支持療法已被廣泛使用,但由于對大腸桿菌性腦膜炎的致病機制還有許多未知之處,致使其發(fā)病率和死亡率仍然居高不下。絕大多數(shù)大腸桿菌性的新生兒腦膜炎是血源性播散的結(jié)果,其發(fā)生的關鍵步驟為血液循環(huán)中的細菌穿越血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)。而血腦屏障最主要的組成部分又是腦微血管內(nèi)皮細胞(brain mic

2、rovascular endothelial cells,BMECs)。大腸桿菌成功穿越血腦屏障需要達到幾個條件,包括嚴重的菌血癥,細菌黏附及侵襲進入腦微血管內(nèi)皮細胞,宿主細胞的細胞骨架重排,以及相關信號途徑的激活等。研究表明,大腸桿菌侵襲腦微血管內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)明顯的時期差異性,即穩(wěn)定生長期的細菌侵襲力要明顯高于處于對數(shù)生長期的細菌。這也提示大腸桿菌K1株穩(wěn)定生長期是其侵襲相關的毒力基因表達的主要時期。
　　 聚磷酸鹽激酶1(po

3、lyphosphate kinase1,PPK1)由聚磷酸鹽激酶基因1編碼,是大腸桿菌內(nèi)負責催化ATP脫磷酸殘基形成聚磷酸鹽的一種主要激酶。多項研究證實,這種激酶或聚磷酸鹽(polyphosphate,ooly P)與多種細菌穩(wěn)定生長期的毒力相關。E.coli K-12株缺失ppk1會導致其穩(wěn)定生長期的壓力適應性及存活能力下降。彎曲弧菌ppk1敲除后會表現(xiàn)出生長、運動及表面黏附能力的下降。綠膿桿菌敲除ppk1后會導致其群體感應和菌膜生成

4、能力產(chǎn)生缺陷。志賀氏菌和沙門氏菌ppk1缺失后穩(wěn)定生長期的存活能力和毒力明顯降低。有學者發(fā)現(xiàn),poly P與σ因子RpoS的表達存在重要關系。ppk1缺失引發(fā)poly P合成減少,會導致RpoS的表達明顯下降。RpoS是一種重要的穩(wěn)定生長期毒力基因調(diào)控蛋白,它參與了包括大腸桿菌O157:H7、傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌、結(jié)腸炎耶爾森氏菌、霍亂弧菌以及伯氏疏螺旋體在內(nèi)的多種致病原的穩(wěn)定生長期毒力表達調(diào)控。然而值得關注得是,E.coli K1

5、 RS218(由新生兒腦膜炎患者腦脊液中分離的E.coliK1株)的rpoS基因上卻存在可導致調(diào)控功能沉默的基因突變。IbeR被證實是該細菌內(nèi)的一個具有RpoS類似功能的調(diào)控蛋白,參與了穩(wěn)定生長期包括毒力和壓力適應性相關的多個基因的表達調(diào)控。借助生物信息學手段預測到,在ibeR基因上游的基因間隔區(qū)存在cAMP受體蛋白的結(jié)合位點。而有學者在傷寒沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)ppk1參與了cAMP受體蛋白的表達調(diào)控,并由此參與了rpoS的表達調(diào)控。那么pp

6、k1/poly P在E.coli K1入侵血腦屏障中扮演什么角色,以及ppk1缺失引起poly P的減少,是否會導致ibeR的表達下調(diào),來參與細菌穩(wěn)定期毒力及壓力適應性的調(diào)控,都是我們希望探索的內(nèi)容。圍繞以上線索,本文主要開展以下幾方面的研究:(1)利用染色體同源重組技術,構(gòu)建E.coli K1 E44株(具有利福平抗性的RS218株)的ppk1基因缺失株及突變回補株,鑒定其基本屬性,并利用glassmilk及甲苯胺藍染色法提取、比較細

7、菌內(nèi)的poly P水平；(2)體外比較野生株、突變株及回補株在滲透壓及酸性環(huán)境壓力的條件下,三者間的生存率的差異；(3)利用人BMEC(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)單層細胞,體外比較野生株、突變株及回補株對HBMEC的黏附和侵襲水平。電鏡觀察黏附和進入HBMEC的細菌。利用血源性乳鼠腦膜炎模型,明確ppk1基因是否影響致病菌穿越血腦屏障的能力。同時利用激光共聚焦技術

8、,比較三者誘導HBMEC肌動蛋白重排的能力:(4)利用熒光定量RT-PCR技術,比較分析野生株、突變株和回補株的ibeR及重要侵襲基因ibeA(與ibeR位于同一操縱子ibeRAT上)的mRNA表達水平。
　　 方法與結(jié)果:
　　 一、大腸桿菌K1致病株ppk1基因敲除及特性分析
　　 1、為了研究ppk1基因在大腸桿菌致病中的毒力相關功能,構(gòu)建ppk1基因敲除株PD44。根據(jù)E44染色體上的ppk1基因及其兩側(cè)

9、的DNA序列,設計合成2對引物,以E44染色體為模板,用PCR分別擴增ppk1基因兩端1.14 kb的A片段和1.28 kb的B片段,分別連接至pGEM—T easy載體上。利用二者帶有的共同酶切位點將A、B連接起來形成AB片段。然后將AB片段亞克隆至自殺載體pCVD442,構(gòu)建自殺重組質(zhì)粒pCVDPK1,轉(zhuǎn)化到SM10λpir,并通過接合性轉(zhuǎn)導的方法將pCVDPK1從SM10λpir轉(zhuǎn)化到E44中,通過氨芐敏感性及PCR方法篩選出pp

10、k1基因缺失株。經(jīng)過PCR、測序等結(jié)果證實成功構(gòu)建E.coli K1的ppk1基因缺失株PD44。
　　 2、K1株E44的ppk1基因全長2064 bp,編碼687個氨基酸,BLAST表明與大腸桿菌K12株PPK1有99％氨基酸序列同源性,將帶有完整ORF的ppk1基因序列插入質(zhì)粒pGEM-T得到重組質(zhì)粒pGEMPK1。用作回補實驗用載體。
　　 3、在營養(yǎng)豐富條件下,E44及PD44菌體的菌落形成和生長能力并無顯著差

11、異。因而突變株適用于研究該基因?qū)Ω腥鞠嚓P毒力的影響。另外通過莢膜染色我們發(fā)現(xiàn),ppk1缺失后細菌仍然可以形成莢膜,這對于細菌在HBMEC的存活非常重要。
　　 4、我們考察了ppk1缺失對E44在培養(yǎng)3小時和18小時的poly P含量。利用glassmilk和甲苯胺藍法檢測,發(fā)現(xiàn)突變株的poly P含量明顯低于野生株,而回補ppk1基因可能使其基本恢復到原來的水平。
　　 二、ppk1缺失降低了大腸桿菌K1株對環(huán)境壓力的

12、適應能力從生長環(huán)境以及感染途徑來看,E.coli K1引發(fā)新生兒腦膜炎可能需要經(jīng)受一些特殊環(huán)境的壓力并生存下來。比如糞便內(nèi)的高滲環(huán)境,新生兒胃部和產(chǎn)婦產(chǎn)道的酸性環(huán)境(人在通常狀況下,胃液的pH值在1～3；陰道內(nèi)pH值約為3.8～4.5)。為了檢測ppk1/poly P在E.coli K1抵抗外界環(huán)境壓力中的作用,我們通過比較ppk1缺失株、回補株以及野生株三者間在熱刺激、高滲透壓以及酸性培養(yǎng)基中的生存率情況。結(jié)果顯示,敲除ppk1基因后

13、,E.coli K1 E44在這些壓力條件下的生存率均明顯下降。這也表明ppk1/poly P在E.coli K1抵抗外界環(huán)境壓力中扮演了重要的角色。
　　 三、ppk1缺失降低了大腸桿菌K1株跨血腦屏障的能力
　　 1、體外模型采用HBMEC單層細胞,實驗前24 h,將BMEC鋪至24孔板,待細胞匯合成單層后備用(約105細胞/孔)。待測細菌37℃靜置培養(yǎng)24 h至穩(wěn)定期,PBS適當稀釋備用,以OD600估算菌濃,按感

14、染倍數(shù),即細菌數(shù):細胞數(shù)約100:1接入待測菌,同時留樣涂平板培養(yǎng)計數(shù)得確切菌濃。37℃孵育2 h后,PBS清洗4次后裂解細胞并涂布LB平板計菌落數(shù),此為黏附的細菌總數(shù),并計算黏附率。侵襲組三個復孔,與100μg/mL慶大霉素37℃孵育1 h來殺死所有胞外細菌,PBS清洗4次,裂解細胞涂布LB平板計菌落數(shù),即為胞內(nèi)菌數(shù),并計算侵襲率。與野生株E441、2和3 h的黏附率相比,PD44黏附BMEC單層細胞能力顯著降低。慶大霉素保護實驗結(jié)果

15、表明,突變株在侵襲水平上也表現(xiàn)出明顯的降低。PD44轉(zhuǎn)化入回補質(zhì)粒pGEMPK1后,突變株黏附能力和侵襲能力基本得到恢復。利用電子顯微鏡,可以觀察到黏附、侵入HBMEC的突變株要少于野生株。
　　 2、用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽對HBMEC進行染色,用共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):未孵育細菌的正常HBMEC組肌動蛋白分布均勻,野生株孵育組胞質(zhì)肌動蛋白減少,出現(xiàn)邊緣聚集以及突觸,而突變株孵育組也出現(xiàn)類似情況,但改變程度明顯弱于野生株組。回

16、補ppk1基因可以使肌動蛋白重排水平恢復到E44組相當水平。
　　 3、五日齡的乳鼠被接種E44及PD44,感染18 h后,血樣及CSF樣本涂布LB平板計菌落數(shù)。接種ppk1基因缺失株PD44可以引起與野生株E44相似水平的菌血癥,然而,23只接種了PD44韻乳鼠只有9只發(fā)生腦膜炎(39％),而同樣數(shù)量接種了野生株E44的乳鼠當中,17只CSF培養(yǎng)呈陽性,占了74％(P=0.036,PearsonChi—Square test]

17、)。聯(lián)合體外及體內(nèi)實驗結(jié)果,ppk1基因缺失導致大腸桿菌K1株穿越血腦屏障的能力明顯降低。
　　 四、ppk1缺失降低了穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR及重要侵襲相關基因ibeA的表達水平為了檢測ppk1敲除是否對穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR表達是否有影響,我們通過實時熒光定量RT-PCR法比較了野生株、突變株及回補株之間的ibeR基因相對拷貝數(shù)。與內(nèi)參基因GAPDH標化后,PD44 ibeR相對拷貝數(shù)為(13.35±2.11),明顯低于FA4

18、的ibeR相對拷貝數(shù)(31.10±7.90)及回補株ibeR相對拷貝數(shù)(23.76±3.71)。IbeA mRNA熒光定量結(jié)果顯示,經(jīng)內(nèi)參基因GAPDH標化后,PD44ibeA相對拷貝數(shù)為(32.12±7.33),明顯低于E44的ibeA相對拷貝數(shù)(57.6±10.31)及回補株ibeA相對拷貝數(shù)(49.71±8.41)。以上結(jié)果表明ppk1敲除引發(fā)poly P產(chǎn)量減少,可導致穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR及重要毒力基因ibeA的表達水平下調(diào)。

19、
　　 統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標準差.兩組間的比較采用t檢驗,多重比較采用單因素方差分析。動物實驗陽性率的比較采用Pearson卡方檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,檢驗水準為α=0.05。數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件。
　　 結(jié)論:ppk1基因在多種微生物內(nèi)包括結(jié)核分枝桿菌,腦膜炎奈瑟菌,幽門螺桿菌,霍亂弧菌,傷寒沙門氏菌等,都是一個高度保守的基因。由于在哺乳動物細胞內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)PPK1的同源物的存在,

20、這就使得PPK1成為潛在的藥物開發(fā)的一個良好靶標。為了明確poly P在大腸桿菌K1株致腦膜炎中的相關作用,我們構(gòu)建了ppk1的基因敲除株,并通過體外、體內(nèi)血腦屏障模型及基因回補實驗對相關特性和功能進行了研究。結(jié)果顯示,在體外實驗中,ppk1的基因敲除株PD44對HBMEC的黏附和侵襲水平明顯低于野生株E44及回補株PD44(pGEMPK1)；與之一致的是,體內(nèi)實驗中PD44穿越血腦屏障的能力也低于E44。同時,我們還檢測了三者之間的p

21、oly P含量,尤其在穩(wěn)定期,E44的poly P積累水平明顯高于PD44(非放射性法基本檢測不到),而ppk1的回補可以使PD44的poly P基本回復到與E44相當?shù)乃?。有一點需要提出的是,敲除ppk1基因后,綠膿桿菌和彎曲弧菌依然存在poly P的累積現(xiàn)象,這是由于這兩種細菌體內(nèi)不僅存在ppk1,而且還存在著能使GTP脫磷產(chǎn)生poly P的ppk2。
　　 在許多致病菌入侵宿主細胞時,都會造成宿主細胞骨架如肌動蛋白的重排

22、及下游信號通路的激活。這種情況同樣存在于腦膜炎大腸桿菌K1株。為了檢測ppk1敲除是否會對E.coli K1誘導的細胞骨架重排產(chǎn)生影響,我們將野生株、突變株及回補株與HBMEC孵育后,用羅丹明-鬼筆環(huán)肽對肌動蛋白進行染色,發(fā)現(xiàn)在正常的HBMEC內(nèi),肌動蛋白排列非常均勻。而野生株及回補株感染的HBMEC,肌動蛋白在胞質(zhì)內(nèi)分布減少,而出現(xiàn)邊緣聚集現(xiàn)象,且可以觀察到突觸的形成。突變株處理過的HBMEC雖然也存在肌動蛋白重排現(xiàn)象,但明顯弱于前兩

23、組。
　　 在E.coli K1引發(fā)腦膜炎的過程中,致病菌還需要面對一些環(huán)境的壓力并存活下來,這也是其致病的機制之一。比如在人體的胃部,致病菌需要抵抗胃酸的刺激。由于產(chǎn)道感染也是新生兒腦膜炎的感染因素之一,因此E.coli K1需面對產(chǎn)婦產(chǎn)道內(nèi)的低pH值環(huán)境。另外糞便內(nèi)的高滲環(huán)境也是致病菌需要抵抗的環(huán)境壓力。作為PPK1催化的酶反應產(chǎn)物,poly P被證實與穩(wěn)定期調(diào)節(jié)子RpoS的表達相關。當敲除ppk1后,poly P減少,導致

24、RpoS的表達下調(diào)。然而在E.coliK1 RS218,rpoS基因存在著導致其功能缺失的基因突變。IbeR為作為另外一個穩(wěn)定期調(diào)節(jié)子參與了致病菌穩(wěn)定期的壓力適應性及毒力基因表達的調(diào)控。通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn),ibeR的缺失會導致TnaA、LpdA、OmpC、TufB、GapA、OmpA、AhpC等蛋白的表達發(fā)生改變。這些蛋白都與E.coli K1的能量代謝或毒力存在著密切的關系。借助生物信息學的方法,黃勝和等還預測到在ibeR基因上游

25、的基因間隔區(qū)有一個cAMP受體蛋白的潛在結(jié)合位點。在一項關于沙門氏菌的研究中已證實,ppk1可以通過cAMP受體蛋白對rpoS產(chǎn)生影響(其基因啟動子區(qū)存在cAMP受體蛋白結(jié)合位點)。為了檢測ppk1是否與E.coli K1的壓力適應性調(diào)控有關系,及是否能通過影響穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR來參與對毒力及壓力適應性的調(diào)控,我們通過體外存活實驗檢測了在pH2.8及高滲透壓的環(huán)境下,野生株、突變株及回補株的生存率。另外我們還通過real time

26、RT-PCR法檢測了ppk1敲除株、野生株及回補株的IbeR和IbeA的mRNA表達水平。通過上述實驗我們發(fā)現(xiàn),ppk1缺失、poly P合成減少,可引起E.coli K1 E44在壓力環(huán)境下的生存率明顯降低。而且可以導致IbeR和IbeA的mRNA表達水平下調(diào)。
　　 綜合以上結(jié)果我們可以得出如下結(jié)論:ppk1/poly P與腦膜炎大腸桿菌K1株致病有著重要的關系,并且可以通過影響穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR及重要毒力基因ibeA的