聚磷酸鹽激酶1在腦膜炎大腸桿菌K1株致病中的相關(guān)功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)K1株是引發(fā)新生兒腦膜炎最常見的革蘭陰性桿菌。盡管抗生素和支持療法已被廣泛使用,但由于對(duì)大腸桿菌性腦膜炎的致病機(jī)制還有許多未知之處,致使其發(fā)病率和死亡率仍然居高不下。絕大多數(shù)大腸桿菌性的新生兒腦膜炎是血源性播散的結(jié)果,其發(fā)生的關(guān)鍵步驟為血液循環(huán)中的細(xì)菌穿越血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)。而血腦屏障最主要的組成部分又是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain mic

2、rovascular endothelial cells,BMECs)。大腸桿菌成功穿越血腦屏障需要達(dá)到幾個(gè)條件,包括嚴(yán)重的菌血癥,細(xì)菌黏附及侵襲進(jìn)入腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,宿主細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排,以及相關(guān)信號(hào)途徑的激活等。研究表明,大腸桿菌侵襲腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的時(shí)期差異性,即穩(wěn)定生長(zhǎng)期的細(xì)菌侵襲力要明顯高于處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌。這也提示大腸桿菌K1株穩(wěn)定生長(zhǎng)期是其侵襲相關(guān)的毒力基因表達(dá)的主要時(shí)期。
   聚磷酸鹽激酶1(po

3、lyphosphate kinase1,PPK1)由聚磷酸鹽激酶基因1編碼,是大腸桿菌內(nèi)負(fù)責(zé)催化ATP脫磷酸殘基形成聚磷酸鹽的一種主要激酶。多項(xiàng)研究證實(shí),這種激酶或聚磷酸鹽(polyphosphate,ooly P)與多種細(xì)菌穩(wěn)定生長(zhǎng)期的毒力相關(guān)。E.coli K-12株缺失ppk1會(huì)導(dǎo)致其穩(wěn)定生長(zhǎng)期的壓力適應(yīng)性及存活能力下降。彎曲弧菌ppk1敲除后會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及表面黏附能力的下降。綠膿桿菌敲除ppk1后會(huì)導(dǎo)致其群體感應(yīng)和菌膜生成

4、能力產(chǎn)生缺陷。志賀氏菌和沙門氏菌ppk1缺失后穩(wěn)定生長(zhǎng)期的存活能力和毒力明顯降低。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),poly P與σ因子RpoS的表達(dá)存在重要關(guān)系。ppk1缺失引發(fā)poly P合成減少,會(huì)導(dǎo)致RpoS的表達(dá)明顯下降。RpoS是一種重要的穩(wěn)定生長(zhǎng)期毒力基因調(diào)控蛋白,它參與了包括大腸桿菌O157:H7、傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌、結(jié)腸炎耶爾森氏菌、霍亂弧菌以及伯氏疏螺旋體在內(nèi)的多種致病原的穩(wěn)定生長(zhǎng)期毒力表達(dá)調(diào)控。然而值得關(guān)注得是,E.coli K1

5、 RS218(由新生兒腦膜炎患者腦脊液中分離的E.coliK1株)的rpoS基因上卻存在可導(dǎo)致調(diào)控功能沉默的基因突變。IbeR被證實(shí)是該細(xì)菌內(nèi)的一個(gè)具有RpoS類似功能的調(diào)控蛋白,參與了穩(wěn)定生長(zhǎng)期包括毒力和壓力適應(yīng)性相關(guān)的多個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控。借助生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)到,在ibeR基因上游的基因間隔區(qū)存在cAMP受體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。而有學(xué)者在傷寒沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)ppk1參與了cAMP受體蛋白的表達(dá)調(diào)控,并由此參與了rpoS的表達(dá)調(diào)控。那么pp

6、k1/poly P在E.coli K1入侵血腦屏障中扮演什么角色,以及ppk1缺失引起poly P的減少,是否會(huì)導(dǎo)致ibeR的表達(dá)下調(diào),來參與細(xì)菌穩(wěn)定期毒力及壓力適應(yīng)性的調(diào)控,都是我們希望探索的內(nèi)容。圍繞以上線索,本文主要開展以下幾方面的研究:(1)利用染色體同源重組技術(shù),構(gòu)建E.coli K1 E44株(具有利福平抗性的RS218株)的ppk1基因缺失株及突變回補(bǔ)株,鑒定其基本屬性,并利用glassmilk及甲苯胺藍(lán)染色法提取、比較細(xì)

7、菌內(nèi)的poly P水平;(2)體外比較野生株、突變株及回補(bǔ)株在滲透壓及酸性環(huán)境壓力的條件下,三者間的生存率的差異;(3)利用人BMEC(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)單層細(xì)胞,體外比較野生株、突變株及回補(bǔ)株對(duì)HBMEC的黏附和侵襲水平。電鏡觀察黏附和進(jìn)入HBMEC的細(xì)菌。利用血源性乳鼠腦膜炎模型,明確ppk1基因是否影響致病菌穿越血腦屏障的能力。同時(shí)利用激光共聚焦技術(shù)

8、,比較三者誘導(dǎo)HBMEC肌動(dòng)蛋白重排的能力:(4)利用熒光定量RT-PCR技術(shù),比較分析野生株、突變株和回補(bǔ)株的ibeR及重要侵襲基因ibeA(與ibeR位于同一操縱子ibeRAT上)的mRNA表達(dá)水平。
   方法與結(jié)果:
   一、大腸桿菌K1致病株ppk1基因敲除及特性分析
   1、為了研究ppk1基因在大腸桿菌致病中的毒力相關(guān)功能,構(gòu)建ppk1基因敲除株P(guān)D44。根據(jù)E44染色體上的ppk1基因及其兩側(cè)

9、的DNA序列,設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物,以E44染色體為模板,用PCR分別擴(kuò)增ppk1基因兩端1.14 kb的A片段和1.28 kb的B片段,分別連接至pGEM—T easy載體上。利用二者帶有的共同酶切位點(diǎn)將A、B連接起來形成AB片段。然后將AB片段亞克隆至自殺載體pCVD442,構(gòu)建自殺重組質(zhì)粒pCVDPK1,轉(zhuǎn)化到SM10λpir,并通過接合性轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將pCVDPK1從SM10λpir轉(zhuǎn)化到E44中,通過氨芐敏感性及PCR方法篩選出pp

10、k1基因缺失株。經(jīng)過PCR、測(cè)序等結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建E.coli K1的ppk1基因缺失株P(guān)D44。
   2、K1株E44的ppk1基因全長(zhǎng)2064 bp,編碼687個(gè)氨基酸,BLAST表明與大腸桿菌K12株P(guān)PK1有99%氨基酸序列同源性,將帶有完整ORF的ppk1基因序列插入質(zhì)粒pGEM-T得到重組質(zhì)粒pGEMPK1。用作回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)用載體。
   3、在營養(yǎng)豐富條件下,E44及PD44菌體的菌落形成和生長(zhǎng)能力并無顯著差

11、異。因而突變株適用于研究該基因?qū)Ω腥鞠嚓P(guān)毒力的影響。另外通過莢膜染色我們發(fā)現(xiàn),ppk1缺失后細(xì)菌仍然可以形成莢膜,這對(duì)于細(xì)菌在HBMEC的存活非常重要。
   4、我們考察了ppk1缺失對(duì)E44在培養(yǎng)3小時(shí)和18小時(shí)的poly P含量。利用glassmilk和甲苯胺藍(lán)法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)突變株的poly P含量明顯低于野生株,而回補(bǔ)ppk1基因可能使其基本恢復(fù)到原來的水平。
   二、ppk1缺失降低了大腸桿菌K1株對(duì)環(huán)境壓力的

12、適應(yīng)能力從生長(zhǎng)環(huán)境以及感染途徑來看,E.coli K1引發(fā)新生兒腦膜炎可能需要經(jīng)受一些特殊環(huán)境的壓力并生存下來。比如糞便內(nèi)的高滲環(huán)境,新生兒胃部和產(chǎn)婦產(chǎn)道的酸性環(huán)境(人在通常狀況下,胃液的pH值在1~3;陰道內(nèi)pH值約為3.8~4.5)。為了檢測(cè)ppk1/poly P在E.coli K1抵抗外界環(huán)境壓力中的作用,我們通過比較ppk1缺失株、回補(bǔ)株以及野生株三者間在熱刺激、高滲透壓以及酸性培養(yǎng)基中的生存率情況。結(jié)果顯示,敲除ppk1基因后

13、,E.coli K1 E44在這些壓力條件下的生存率均明顯下降。這也表明ppk1/poly P在E.coli K1抵抗外界環(huán)境壓力中扮演了重要的角色。
   三、ppk1缺失降低了大腸桿菌K1株跨血腦屏障的能力
   1、體外模型采用HBMEC單層細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)前24 h,將BMEC鋪至24孔板,待細(xì)胞匯合成單層后備用(約105細(xì)胞/孔)。待測(cè)細(xì)菌37℃靜置培養(yǎng)24 h至穩(wěn)定期,PBS適當(dāng)稀釋備用,以O(shè)D600估算菌濃,按感

14、染倍數(shù),即細(xì)菌數(shù):細(xì)胞數(shù)約100:1接入待測(cè)菌,同時(shí)留樣涂平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)得確切菌濃。37℃孵育2 h后,PBS清洗4次后裂解細(xì)胞并涂布LB平板計(jì)菌落數(shù),此為黏附的細(xì)菌總數(shù),并計(jì)算黏附率。侵襲組三個(gè)復(fù)孔,與100μg/mL慶大霉素37℃孵育1 h來殺死所有胞外細(xì)菌,PBS清洗4次,裂解細(xì)胞涂布LB平板計(jì)菌落數(shù),即為胞內(nèi)菌數(shù),并計(jì)算侵襲率。與野生株E441、2和3 h的黏附率相比,PD44黏附BMEC單層細(xì)胞能力顯著降低。慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

15、表明,突變株在侵襲水平上也表現(xiàn)出明顯的降低。PD44轉(zhuǎn)化入回補(bǔ)質(zhì)粒pGEMPK1后,突變株黏附能力和侵襲能力基本得到恢復(fù)。利用電子顯微鏡,可以觀察到黏附、侵入HBMEC的突變株要少于野生株。
   2、用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)HBMEC進(jìn)行染色,用共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):未孵育細(xì)菌的正常HBMEC組肌動(dòng)蛋白分布均勻,野生株孵育組胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白減少,出現(xiàn)邊緣聚集以及突觸,而突變株孵育組也出現(xiàn)類似情況,但改變程度明顯弱于野生株組?;?/p>

16、補(bǔ)ppk1基因可以使肌動(dòng)蛋白重排水平恢復(fù)到E44組相當(dāng)水平。
   3、五日齡的乳鼠被接種E44及PD44,感染18 h后,血樣及CSF樣本涂布LB平板計(jì)菌落數(shù)。接種ppk1基因缺失株P(guān)D44可以引起與野生株E44相似水平的菌血癥,然而,23只接種了PD44韻乳鼠只有9只發(fā)生腦膜炎(39%),而同樣數(shù)量接種了野生株E44的乳鼠當(dāng)中,17只CSF培養(yǎng)呈陽性,占了74%(P=0.036,PearsonChi—Square test]

17、)。聯(lián)合體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,ppk1基因缺失導(dǎo)致大腸桿菌K1株穿越血腦屏障的能力明顯降低。
   四、ppk1缺失降低了穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR及重要侵襲相關(guān)基因ibeA的表達(dá)水平為了檢測(cè)ppk1敲除是否對(duì)穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR表達(dá)是否有影響,我們通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法比較了野生株、突變株及回補(bǔ)株之間的ibeR基因相對(duì)拷貝數(shù)。與內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)化后,PD44 ibeR相對(duì)拷貝數(shù)為(13.35±2.11),明顯低于FA4

18、的ibeR相對(duì)拷貝數(shù)(31.10±7.90)及回補(bǔ)株ibeR相對(duì)拷貝數(shù)(23.76±3.71)。IbeA mRNA熒光定量結(jié)果顯示,經(jīng)內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)化后,PD44ibeA相對(duì)拷貝數(shù)為(32.12±7.33),明顯低于E44的ibeA相對(duì)拷貝數(shù)(57.6±10.31)及回補(bǔ)株ibeA相對(duì)拷貝數(shù)(49.71±8.41)。以上結(jié)果表明ppk1敲除引發(fā)poly P產(chǎn)量減少,可導(dǎo)致穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR及重要毒力基因ibeA的表達(dá)水平下調(diào)。

19、
   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差.兩組間的比較采用t檢驗(yàn),多重比較采用單因素方差分析。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)陽性率的比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件。
   結(jié)論:ppk1基因在多種微生物內(nèi)包括結(jié)核分枝桿菌,腦膜炎奈瑟菌,幽門螺桿菌,霍亂弧菌,傷寒沙門氏菌等,都是一個(gè)高度保守的基因。由于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)PPK1的同源物的存在,

20、這就使得PPK1成為潛在的藥物開發(fā)的一個(gè)良好靶標(biāo)。為了明確poly P在大腸桿菌K1株致腦膜炎中的相關(guān)作用,我們構(gòu)建了ppk1的基因敲除株,并通過體外、體內(nèi)血腦屏障模型及基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)特性和功能進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,在體外實(shí)驗(yàn)中,ppk1的基因敲除株P(guān)D44對(duì)HBMEC的黏附和侵襲水平明顯低于野生株E44及回補(bǔ)株P(guān)D44(pGEMPK1);與之一致的是,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中PD44穿越血腦屏障的能力也低于E44。同時(shí),我們還檢測(cè)了三者之間的p

21、oly P含量,尤其在穩(wěn)定期,E44的poly P積累水平明顯高于PD44(非放射性法基本檢測(cè)不到),而ppk1的回補(bǔ)可以使PD44的poly P基本回復(fù)到與E44相當(dāng)?shù)乃?。有一點(diǎn)需要提出的是,敲除ppk1基因后,綠膿桿菌和彎曲弧菌依然存在poly P的累積現(xiàn)象,這是由于這兩種細(xì)菌體內(nèi)不僅存在ppk1,而且還存在著能使GTP脫磷產(chǎn)生poly P的ppk2。
   在許多致病菌入侵宿主細(xì)胞時(shí),都會(huì)造成宿主細(xì)胞骨架如肌動(dòng)蛋白的重排

22、及下游信號(hào)通路的激活。這種情況同樣存在于腦膜炎大腸桿菌K1株。為了檢測(cè)ppk1敲除是否會(huì)對(duì)E.coli K1誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排產(chǎn)生影響,我們將野生株、突變株及回補(bǔ)株與HBMEC孵育后,用羅丹明-鬼筆環(huán)肽對(duì)肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)在正常的HBMEC內(nèi),肌動(dòng)蛋白排列非常均勻。而野生株及回補(bǔ)株感染的HBMEC,肌動(dòng)蛋白在胞質(zhì)內(nèi)分布減少,而出現(xiàn)邊緣聚集現(xiàn)象,且可以觀察到突觸的形成。突變株處理過的HBMEC雖然也存在肌動(dòng)蛋白重排現(xiàn)象,但明顯弱于前兩

23、組。
   在E.coli K1引發(fā)腦膜炎的過程中,致病菌還需要面對(duì)一些環(huán)境的壓力并存活下來,這也是其致病的機(jī)制之一。比如在人體的胃部,致病菌需要抵抗胃酸的刺激。由于產(chǎn)道感染也是新生兒腦膜炎的感染因素之一,因此E.coli K1需面對(duì)產(chǎn)婦產(chǎn)道內(nèi)的低pH值環(huán)境。另外糞便內(nèi)的高滲環(huán)境也是致病菌需要抵抗的環(huán)境壓力。作為PPK1催化的酶反應(yīng)產(chǎn)物,poly P被證實(shí)與穩(wěn)定期調(diào)節(jié)子RpoS的表達(dá)相關(guān)。當(dāng)敲除ppk1后,poly P減少,導(dǎo)致

24、RpoS的表達(dá)下調(diào)。然而在E.coliK1 RS218,rpoS基因存在著導(dǎo)致其功能缺失的基因突變。IbeR為作為另外一個(gè)穩(wěn)定期調(diào)節(jié)子參與了致病菌穩(wěn)定期的壓力適應(yīng)性及毒力基因表達(dá)的調(diào)控。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),ibeR的缺失會(huì)導(dǎo)致TnaA、LpdA、OmpC、TufB、GapA、OmpA、AhpC等蛋白的表達(dá)發(fā)生改變。這些蛋白都與E.coli K1的能量代謝或毒力存在著密切的關(guān)系。借助生物信息學(xué)的方法,黃勝和等還預(yù)測(cè)到在ibeR基因上游

25、的基因間隔區(qū)有一個(gè)cAMP受體蛋白的潛在結(jié)合位點(diǎn)。在一項(xiàng)關(guān)于沙門氏菌的研究中已證實(shí),ppk1可以通過cAMP受體蛋白對(duì)rpoS產(chǎn)生影響(其基因啟動(dòng)子區(qū)存在cAMP受體蛋白結(jié)合位點(diǎn))。為了檢測(cè)ppk1是否與E.coli K1的壓力適應(yīng)性調(diào)控有關(guān)系,及是否能通過影響穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR來參與對(duì)毒力及壓力適應(yīng)性的調(diào)控,我們通過體外存活實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了在pH2.8及高滲透壓的環(huán)境下,野生株、突變株及回補(bǔ)株的生存率。另外我們還通過real time

26、RT-PCR法檢測(cè)了ppk1敲除株、野生株及回補(bǔ)株的IbeR和IbeA的mRNA表達(dá)水平。通過上述實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),ppk1缺失、poly P合成減少,可引起E.coli K1 E44在壓力環(huán)境下的生存率明顯降低。而且可以導(dǎo)致IbeR和IbeA的mRNA表達(dá)水平下調(diào)。
   綜合以上結(jié)果我們可以得出如下結(jié)論:ppk1/poly P與腦膜炎大腸桿菌K1株致病有著重要的關(guān)系,并且可以通過影響穩(wěn)定期調(diào)節(jié)基因ibeR及重要毒力基因ibeA的

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