內(nèi)質網(wǎng)應激反應性凋亡機制及其體外調控在K562細胞中的初步研究.pdf

1、細胞凋亡是一個復雜的病理生理過程，在維持機體平衡、疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其腫瘤的形成等方面發(fā)揮著重要作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)除死亡受體途徑和線粒體途徑外，內(nèi)質網(wǎng)可能是細胞內(nèi)誘導凋亡的重要新場所，并提出內(nèi)質網(wǎng)應激反應性凋亡途徑。隨著凋亡機制研究的深入，細胞凋亡的誘導或抑制在疾病治療領域呈現(xiàn)越來越重要的作用，尤其是腫瘤凋亡誘導治療。本課題以白血病敏感細胞株K562細胞和多藥耐藥細胞株K562/A02細胞為研究對象，以內(nèi)質網(wǎng)Ca2+-ATP酶抑制劑

2、毒胡蘿卜素為內(nèi)質網(wǎng)應激誘導劑，探討了毒胡蘿卜素對白血病細胞的凋亡誘導作用及其機制和體外調控以及毒胡蘿卜素對K562/A02細胞化療敏感性的影響，期望為白血病治療提供一種新的靶點和策略。本文共分為四個部分。 第一部分毒胡蘿卜素對K562和K562/A02細胞的凋亡誘導研究 目的:探討毒胡蘿卜素對白血病敏感細胞株K562細胞和多藥耐藥細胞株K562/A02細胞的凋亡誘導作用。 方法:采用Hoechst33258單染法

3、、丫啶橙/溴化乙錠雙染法觀察凋亡細胞形態(tài)變化，透射電子顯微鏡觀察凋亡細胞超微結構變化，AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測細胞凋亡率變化。 結果:白血病敏感細胞株K562和多藥耐藥細胞株K562/A02細胞經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，經(jīng)Hoechst33258單染法和丫啶橙/溴化乙錠雙染法染色，倒置熒光顯微鏡下觀察可見，K562和K562/A02細胞均呈典型的凋亡細胞形態(tài)改變，即細胞體積變小、核固縮并向核膜靠攏，DN

4、A斷裂成斑快狀，而正常細胞呈彌漫性均勻熒光，呈正常結構；透射電鏡觀察顯示：實驗組K562和K562/A02細胞細胞核內(nèi)的異染色質發(fā)生固縮、邊集，核仁消失，胞漿中有空泡，原生質著色不均勻，可見凋亡細胞表面出泡，最終脫落形成膜包被的凋亡小體，而對照組細胞細胞核形態(tài)正常；AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測結果顯示毒胡蘿卜素誘導K562和K562/A02細胞發(fā)生典型的細胞凋亡，細胞凋亡率在一定范圍內(nèi)呈濃度和時間依賴性。

5、 結論:內(nèi)質網(wǎng)應激誘導劑毒胡蘿卜素誘導白血病敏感細胞株K562和多藥耐藥細胞株K562/A02細胞發(fā)生典型的凋亡改變，并且細胞凋亡率在一定范圍內(nèi)呈濃度和時間依賴性。 第二部分毒胡蘿卜素誘導K562和K562/A02細胞內(nèi)質網(wǎng)應激反應性凋亡的機制研究 目的:探討毒胡蘿卜素誘導白血病敏感細胞株K562和多藥耐藥細胞株K562/A02細胞發(fā)生內(nèi)質網(wǎng)應激反應性凋亡的可能機制。 方法:(略） 結果:細

6、胞內(nèi)[Ca2+]i檢測結果顯示，靜息狀態(tài)下K562/A02細胞內(nèi)[Ca2+]i明顯高于K562細胞(P＜0.05)；與對照組比較，毒胡蘿卜素處理后的K562和K562/A02細胞內(nèi)[Ca2+]i均出現(xiàn)不同程度的升高(P＜0.05)，并在一定范圍內(nèi)具有明顯的濃度依賴性。Westernblot檢測結果顯示，毒胡蘿卜素處理后的K562和K562/A02細胞內(nèi)內(nèi)質網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達明顯增加，caspase-3，-7，-9，-12均出現(xiàn)不同

7、程度的剪切和活化，線粒體釋放細胞色素c明顯增加。流式細胞儀分析結果顯示，與對照組比較，毒胡蘿卜素處理后的K562和K562/A02細胞線粒體跨膜電位△ψm均出現(xiàn)不同程度的下降(P＜0.05)，并在一定范圍內(nèi)呈一定的濃度依賴性。 可見光分光光度計檢測表明，與對照組比較，實驗組細胞內(nèi)GSH濃度均出現(xiàn)不同程度的降低(P＜0.05)，并呈一定的濃度依賴性。 結論:毒胡蘿卜素抑制內(nèi)質網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性并誘導內(nèi)質網(wǎng)儲存鈣的釋放

8、和內(nèi)質網(wǎng)應激反應性凋亡的發(fā)生；內(nèi)質網(wǎng)應激反應誘導Caspase-12活化，活化的Caspase-12可能直接剪切活化Caspase-3，-7，-9，而Caspase-9的活化可能通過caspase-12活化和線粒體釋放細胞色素C形成凋亡體兩種途徑實現(xiàn)并直接活化Caspase-3，-7；Caspase-3，-7，-9，-12的剪切活化、線粒體跨膜電位△ψm的下降、線粒體細胞色素c的釋放增加以及細胞內(nèi)GSH濃度的降低可能是白血病細胞發(fā)生內(nèi)質

9、網(wǎng)應激反應性凋亡的重要機制之一；同時線粒體凋亡途徑與內(nèi)質網(wǎng)應激反應性凋亡途徑之間可能存在內(nèi)在聯(lián)系和凋亡信號放大環(huán)。 第三部分毒胡蘿卜素誘導K562和K562/A02細胞內(nèi)質網(wǎng)應激反應性凋亡的體外調控研究 目的:初步探討毒胡蘿卜素誘導白血病敏感細胞株K562和多藥耐藥細胞株K562/A02細胞發(fā)生內(nèi)質網(wǎng)應激性凋亡的體外調控機制。 方法:RT-PCR檢測凋亡調節(jié)基因Bcl-2、Bax、Bcl-XL、XIAP

10、和survivin以及MAGE-3基因mRNA表達水平的變化；免疫組織化學染色法檢測Bcl-2、Bax、Bcl-XL、XIAP、survivin和MAGE-3基因的蛋白質表達水平變化。 結果:RT-PCR檢測結果顯示，毒胡蘿卜素處理后，K562細胞促凋亡基因BaxmRNA表達明顯上調，抑凋亡基因Bcl-2、survivinmRNA表達下調，但survivin表達下調更明顯，MAGE-3mRNA表達也是降低的，而抑凋亡基因Bcl-

11、XL、XIAPmRNA表達上調，Bcl-2/BaxmRNA表達相對量比值降低；K562/A02細胞凋亡調節(jié)基因Bcl-2和BaxmRNA表達明顯下調，Bcl-2/BaxmRNA相對量比值降低，抑凋亡基因Bcl-XL、XIAP、survivinmRNA表達均出現(xiàn)不同程度的下調，但以XIAPmRNA表達下調最明顯，MAGE-3mRNA表達明顯下調。免疫組織化學染色結果顯示，與對照組比較，實驗組K562細胞Bcl-2家族成員Bax、Bcl-X

12、L蛋白表達增加(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達亦增加，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，凋亡抑制蛋白IAP家族成員survivin蛋白表達明顯降低(P＜0.05)，而XIAP蛋白表達明顯增加(P＜0.01)，MAGE-3蛋白表達明顯降低(P＜0.05)，Bcl-2/Bax蛋白質比值下調；實驗組K562/A02細胞與對照組比較，促凋亡成員Bax蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，抑制凋亡成員Bcl-2蛋白表達則明顯下調(P＜0.05)，B

13、cl-XL蛋白表達亦降低但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，凋亡抑制蛋白IAP家族成員survivin(P＜0.01)和XIAP(P＜0.05)蛋白表達均明顯下調，Bcl-2/Bax蛋白質比值明顯降低，對照組和實驗組分別為0.8621和0.3228，MAGE-3蛋白表達亦明顯降低(P＜0.05)。 結論:內(nèi)質網(wǎng)應激反應性凋亡過程中，K562細胞mRNA和蛋白質水平上Bax表達明顯增加、Bcl-2/Bax比值下調、survivin表達

14、明顯降低和MAGE-3表達明顯下調可能發(fā)揮重要促凋亡作用，Bcl-XL和XIAP表達明顯上調可能發(fā)揮重要抑凋亡作用；K562/A02細胞Bax蛋白質表達明顯增加、Bcl-2、survivin、XIAP和MAGE-3基因mRNA和蛋白質水平表達明顯降低和Bcl-2/Bax比值下調可能發(fā)揮重要促凋亡作用。 第四部分毒胡蘿卜素對K562/A02細胞多藥耐藥性的逆轉及其機制研究 目的:探討毒胡蘿卜素對白血病多藥耐藥細胞

15、株K562/A02細胞化療敏感性的影響及其可能機制。 方法：（略） 結果:MTT法檢測結果顯示，毒胡蘿卜素對K562細胞和K562/A02細胞均有劑量和時間依賴性的增殖抑制作用，并且K562/A02細胞較K562細胞對毒胡蘿卜素稍敏感，K562/A02細胞對ADM、DNR、VCR、VP-16、HHT和MXT呈現(xiàn)不同程度的交叉耐藥性，毒胡蘿卜素可不同程度地提高K562/A02細胞對ABM、DNR、VCR、VP-16、HHT

16、、MXT的化療敏感性或部分逆轉K562/A02細胞的多藥耐藥性；流式細胞儀和倒置熒光顯微鏡檢測結果顯示，毒胡蘿卜素具有抑制P-gp功能的作用，但對K562/A02細胞P-gp表達無影響；可見光分光光度計檢測結果顯示毒胡蘿卜素處理后的K562/A02細胞內(nèi)GSH濃度出現(xiàn)不同程度的降低；免疫組織化學染色結果表明毒胡蘿卜素誘導K562/A02細胞Bcl-2、survivin、XIAP和MAGE-3蛋白質表達明顯下調以及Bax蛋白表達明顯增加和

17、Bcl-2/Bax蛋白質比值降低，而對Bcl-XL蛋白質表達無明顯影響。 結論:毒胡蘿卜素能提高K562/A02細胞的化療敏感性或部分逆轉K562/A02細胞的多藥耐藥性；毒胡蘿卜素的凋亡誘導或細胞增殖抑制作用、對P-gp功能的抑制作用、促使細胞內(nèi)GSH濃度降低、誘導細胞Bcl-2、survivin、XIAP和MAGE-3蛋白質表達明顯下調以及Bax蛋白表達明顯增加和Bcl-2/Bax蛋白質比值降低可能是毒胡蘿卜素逆轉K562/