Dishevelled家族蛋白表達于非小細胞肺癌并通過不同機制促進腫瘤進展.pdf

1、Wnt/β-catenin信號通路在從水螅到人等動物的胚胎發(fā)育和干細胞維持中其重要作用。該通路的關鍵環(huán)節(jié)是調節(jié)細胞漿內β-catenin的穩(wěn)定性。在沒有Wnt信號的情況下，由APC、Axin、GSK3β和CKIa等組成的復合物能識別細胞內的游離β-catenin并介導它通過磷酸化依賴的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)快速降解，從而使細胞內游離的β-catenin保持在極低的水平。這時候TCF/LEF轉錄因子在細胞核內與轉錄抑制因子結合，從而抑制Wnt

2、下游靶基因的表達。當細胞外Wnt分子達到一定濃度時，Wnt分子與細胞膜受體Frizzled(Fz)結合并使之激活。激活的Fz能促進細胞漿內的Dishevelled(Dvl)在細胞膜處多聚化并與LRP5/6結合形成配體-受體復合物而募集Axin至細胞膜處或促進其降解。此時，APC、Axin、GSK3β和CKIa等組成的降解復合物解散或形成減少，β-catenin的磷酸化和降解過程被抑制，從而導致細胞內游離β-catenin水平升高并在細胞

3、漿內蓄積，進而入核與TCF/LEF轉錄因子結合，從而激活Wnt靶基因的轉錄。與細胞增殖和細胞周期相關的基因如c-myc、cyclin D1等已被證實為Wnt/β-catenin通路的靶基因。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路的異常激活可以導致包括腫瘤在內的許多疾病的發(fā)生，如大腸癌及肝癌等。雖然β-catenin在許多腫瘤中存在異常表達，但是β-cmenin基因的突變卻并不常見，因此Wnt/β-catenin通路的激活可

4、能是由于β-catenin上游分子的改變導致。Dishevelled(Dvl)是Wnt/β-catenin信號通路中位于β-catenin上游的正向調節(jié)因子，其在Wnt/β-catenin通路中的作用機制仍不清楚。人類Dishevelled基因家族有DVL1、DVL2和DVL3三個成員，分別定位于染色體1p36、17p13.2和3q27。它們編碼的三種蛋白(Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3)均包含高度保守的DIX、PDZ和DEP三個基

5、本結構域。最近有研究報道乳腺癌、前列腺癌、宮頸鱗狀細胞癌、大腸癌和肺癌中存在Dvl的過表達并提示W(wǎng)nt/β-catenin通路可能存在異常激活，但這些研究結果存在爭議，而且研究的樣本量很小。此外，Dvl在腫瘤中的表達與臨床病理因素之間是否存在相關性，尚不清楚。本課題主要研究非小細胞肺癌中Dvl家族各成員的表達情況，分析它們與肺癌患者臨床病理因素和β-catenin表達的關系，同時探討Dvl過表達對肺癌細胞β-catenin表達及侵襲能力

6、的影響。旨在揭示Dvl和Wnt/β-catenin信號通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 實驗材料與方法： 113例非小細胞肺癌患者的原發(fā)灶組織及其中39例患者的配對淋巴結轉移癌組織標本收集自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2003～2006年存檔蠟塊。原發(fā)灶蠟塊均包含正常肺上皮組織。113例患者中，男性68例，女性45例，男女性別比1.5：1。手術切除時患者年齡20～81歲(中位年齡57歲)。按UICC(2002年)腫瘤TNM

7、分期標準：Ⅰ期27例，Ⅱ期24例，Ⅲ期56例，Ⅳ期6例。按WHO(2004年)肺癌分類標準：鱗狀細胞癌48例，腺癌65例。所有病例術前均未接受過放、化療。我們采用免疫組化SP法檢測了這113例標本中總Dvl、Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白的表達，同時對其中39例患者原發(fā)灶和淋巴結轉移灶配對標本的Dvl和β-catenin蛋白表達進行對比分析。此外，我們在Dvl-2有一定豐度表達而Dvl-1和Dvl-3低/無表達的A549肺腺癌細

8、胞系和QG56肺鱗癌細胞系中過表達Dvl-1和Dvl-3后，通過間接免疫熒光染色、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、免疫印跡(Western blotting)和基質膠侵襲實驗等方法檢測了外源性Dvl-1和Dvl-3表達對β-catenin表達及肺癌細胞侵襲能力的影響。 實驗結果： 分化成熟的正常支氣管上皮和肺泡上皮總Dvl蛋白及Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3均呈陰性表達。而肺癌組織中總Dvl陽性表達率為53.

9、1％(60/113)，在腺癌中的表達高于鱗癌(p<0.01)，并與肺癌低分化有關(p<0.05)。肺癌中總Dvl的表達與高pTNM分期有關(Ⅲ-IV期vs．Ⅰ-Ⅱ期，p<0.05)。肺癌中存在Dvl各亞型的表達，Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3陽性率分別為36.3％(41/113)、36.3％(41/113)和41.6％(47/113)，它們在腺癌中的表達均高于鱗癌(p<0.01)并與肺癌的低分化有關(p<0.05)。Ⅲ-Ⅳ

10、期肺癌中Dvl-1和Dvl-2的表達明顯高于Ⅰ-Ⅱ期肺癌(P<0.05)。在39例配對肺癌資料中，總Dvl、Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3在淋巴結轉移灶中的陽性表達率分別87.2％(34/39)、69.2％(27/39)、51.3％(20/39)和69.2％(27/39)，在原發(fā)灶中的陽性表達率分別為64.1％(25/39)、48.7％(19/39)、35.9％(14/39)和48.7％(19/39)?？侱vl、Dvl-1和Dvl-

11、3在淋巴結中的陽性表達率明顯高于配對原發(fā)灶組織(p<0.05)。Dvl-2在轉移灶和原發(fā)灶表達差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。配對資料中，原發(fā)灶總Dvl和Dvl-2的表達與β-catenin表達相關(p<0.05)，而Dvl-1和Dvl-3的表達與β-catenin表達無關(p>0.05)；轉移灶中總Dvl和Dvl-1的表達與β-catenin表達相關(p<0.05)，而Dvl-2和Dvl-3的表達與β-catenin表達無關(p>0

12、.05)。在細胞系實驗中，轉染Dvl-1后A549和QG56細胞出現(xiàn)了明顯的Dvl-1蛋白核定位，但轉染Dvl-3的A549和QG56細胞卻無明顯Dvl-3蛋白核定位。過表達Dvl-1或Dvl-3對兩種肺癌細胞系的β-catenin mRNA水平均無明顯影響(p>0.05)，但過表達Dvl-1能上調A549和QG56細胞β-catenin蛋白水平(p<0.05)，而過表達Dvl-3不影響QG56細胞的β-catenin蛋白水平(p>0.

13、05)，卻下調了A549細胞的β-catenin蛋白水平(p<0.05)。在A549和QG56肺癌細胞中過表達Dvl-1或Dvl-3后，兩種肺癌細胞系的侵襲能力均明顯強于對照組細胞(p<0.01)。 結論： 1、肺鱗癌和腺癌中存在Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白的陽性表達，而分化成熟的肺支氣管上皮對任何一種Dvl蛋白均呈陰性表達。肺腺癌中Dvl蛋白的陽性表達率高于鱗癌并與肺癌的低分化有關。 2、Dvl-1和

14、Dvl-2蛋白的陽性表達與肺癌的高TNM分期相關。淋巴結轉移灶中Dvl-1和Dvl-3蛋白表達高于原發(fā)灶。原發(fā)灶Dvl-2與β-catenin表達相關，而轉移灶中Dvl-1與β-catenin表達相關。 3、過表達Dvl-1和Dvl-3均能促進肺癌細胞的侵襲。在不影響β-catenin轉錄水平的情況下，過表達Dvl-1能升高肺癌細胞的β-catenin蛋白水平，而過表達Dvl-3不改變甚至降低肺癌細胞的β-catenin蛋白水平