腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在DN發(fā)病中的作用及大黃酸對(duì)其影響的研究.pdf

1、背景及目的: 腎小管間質(zhì)病變是糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)進(jìn)展為終末期腎臟病(ESRD)的重要病理基礎(chǔ)，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在腎間質(zhì)過(guò)量堆積是其基本病理特征。目前認(rèn)為腎間質(zhì)ECM主要由肌成纖維細(xì)胞(MyoF)分泌。研究發(fā)現(xiàn)在病理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生上皮細(xì)胞—肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-myofibroblasttransdifferentiation，EMT)，即喪失原有的上

2、皮細(xì)胞表型特征，而獲得MyoF 的新特征，是腎間質(zhì)MyoF的重要來(lái)源。有研究報(bào)道，在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型大鼠，EMT參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。但在DN腎小管間質(zhì)病變進(jìn)程中，是否也存在上述EMT過(guò)程尚不清楚。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β<,1>(TGF-β<,1>)是EMT的重要啟動(dòng)和促進(jìn)因子。TGF-β<,1>的生物學(xué)作用廣泛而復(fù)雜，具有正面和負(fù)面的多樣效應(yīng)。單純抑制TGF-β<,1>這一上游因子，則可能在抑制EMT的同時(shí)引

3、起其他不利的負(fù)效應(yīng)。于是，尋找作用更特異、有效的下游因子或環(huán)節(jié)，成為新近研究的關(guān)注熱點(diǎn)。整合素連接激酶(Integrin-linked kinase，ILK)是新近發(fā)現(xiàn)的一種與整合素細(xì)胞內(nèi)區(qū)域結(jié)合的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，已有研究證實(shí)ILK是整合素、生長(zhǎng)因子、MAPK及Wnt等多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路的交叉點(diǎn)和重要效應(yīng)物。以往對(duì)ILK的研究主要集中在腎小球，近年在UUO模型大鼠和體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究結(jié)果表明，腎間質(zhì)ECM的聚積與ILK表達(dá)正相關(guān)；

4、 ILK介導(dǎo)TGF-β<,1>/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路，可能參與腎小管EMT過(guò)程。然而，在DN腎小管上皮細(xì)胞中ILK表達(dá)情況及其與EMT關(guān)系，目前所知尚少。 人們一直在努力尋找能有效阻抑腎間質(zhì)纖維化的藥物。大黃是臨床治療慢性腎臟病處方使用頻率很高的一味中藥。大黃酸(Rhein)是從大黃蒽醌衍生物中分離出的一種前體組分，為大黃的主要有效成分。臨床與實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均表明大黃酸能有效減緩慢性腎臟病進(jìn)程，具有肯定的腎臟保護(hù)作用。但大黃酸對(duì)D

5、N的小管間質(zhì)病變及EMT過(guò)程的作用、影響，尚少見報(bào)道。本研究擬從糖尿病大鼠模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)層面，采用反映上皮細(xì)胞表型特征的E鈣粘素(E-Cadherin)、反映MyoF表型特征的α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和作為ECM成分的纖維連接蛋白(FN)等指標(biāo)，觀察在DN小管間質(zhì)病變中，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與ILK表達(dá)的改變，以及EMT與ILK的關(guān)系；并用大黃酸干預(yù)處理，觀察大黃酸對(duì)上述過(guò)程的影響。旨在從EMT這一新途徑，探討DN病變

6、進(jìn)展新機(jī)制，尋找DN防治的新靶點(diǎn)。 方法: (一)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組，n=12)、糖尿病模型組(D組，n=12)和糖尿病大黃酸干預(yù)組(R組，n=12)。采用腹腔內(nèi)一次注射 STZ 55mg·kg<'-1>誘導(dǎo)糖尿病模型。大黃酸組大鼠于糖尿病成模后，給予大黃酸100mg·kg<'-1>·d<'-1>灌胃。分別于第8、16周末，每組隨機(jī)選取6只大鼠，留24小時(shí)尿測(cè)定尿蛋白排泄量

7、；處死大鼠，心臟取血測(cè)血清肌酐(SCr)、血甘油三酯(TG)和膽固醇(CH)；腎臟原位灌洗后，取腎組織：石蠟切片，HE和Masson染色觀察腎小管間質(zhì)損害及纖維化；免疫組化法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK的表達(dá)；免疫印跡方法檢測(cè)腎組織E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK蛋白的表達(dá)。 (二)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分 應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，按下列實(shí)驗(yàn)條件分組培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)：空

8、白對(duì)照(N組)，低糖(5.5mmol/L)DMEM培養(yǎng)基；高糖(D組)葡萄糖濃度30mmol/L；高糖+大黃酸25μg/ml(R-25組)；高糖+大黃酸50μg/ml(R-50組)；高糖+大黃酸100μg/ml(R-100組)。分別于24h、48h、72h收集各組細(xì)胞，免疫印跡方法檢測(cè)E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK的蛋白表達(dá)。結(jié)果: 1.D組和R組糖尿病大鼠的尿蛋白量、血清肌酐值與腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、間質(zhì)膠原相對(duì)

9、面積等均隨病程進(jìn)展而增加，明顯高于同期N組(P<0.01)；大黃酸(R組)能減輕上述病變。16周時(shí)R組較同期D組，其腎臟保護(hù)作用更顯著(P<0.05)。 2.D組和R組糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞：E-Cadherin表達(dá)隨病程逐漸減少(P<0.05)，而α-SMA、FN表達(dá)逐漸增加，均較同期N組有顯著差異(P<0.05，P<0.01)；同時(shí)，ILK表達(dá)也明顯上調(diào)(P<0.05)。ILK與E-Cadherin呈負(fù)相關(guān)(r<,s>=-

10、0.82，P<0.05)，與α-SMA、FN 呈正相關(guān)(r<,s>=0.83，P<0.05；r<,s>=0.94，P<0.01；)。大黃酸干預(yù)可改善上述變化，16周時(shí)R組較同期D組各指標(biāo)的改善呈現(xiàn)顯著差異(P<0.01)。 3.高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞(D組)與N組比較，E-Cadherin的蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；ILK、α-SMA、FN蛋白的表達(dá)增多(P<0.05)。經(jīng)大黃酸處理后的各R組與D組比較E-Cadherin的

11、蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，α-SMA、FN及ILK、蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，且與大黃酸呈劑量、時(shí)間依賴性關(guān)系(P<0.05)。 結(jié)論: 1. 高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞與糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞，E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA、FN表達(dá)增加，表明DN腎小管間質(zhì)病變進(jìn)程中，存在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)，成為MyoF的重要來(lái)源。 2.在DN病理狀態(tài)下，腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)ILK高表達(dá)，且與EMT過(guò)