重癥肌無力胸腺組織相關(guān)蛋白鑒定研究.pdf

1、目的 初步建立MG胸腺組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，獲得雙向電泳凝膠圖譜，篩選出胸腺組織重癥肌無力相關(guān)蛋白，并對(duì)其作出鑒定。從而尋找MG發(fā)病新線索，幫助臨床診斷和治療。 方法 (1)提取3例MG患者增生型胸腺組織蛋白，以7cmpH3-10IPG膠條做第一向IEF，12％SDS-PAGE垂直電泳為第二向，分析二維電泳系統(tǒng)的重復(fù)性；以17cmpH3-10IPG膠條做第一向IEF，評(píng)價(jià)分別由樣品裂解液Ⅰ和Ⅱ組成的兩種不同胸腺

2、組織蛋白提取方法。通過對(duì)這些實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，獲得MG增生型胸腺組織蛋白雙向電泳凝膠圖譜。 (2)分別利用異體MG患者血清、正常人血清和自身免疫病患者血清為第一抗體，與電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的蛋白點(diǎn)孵育，做WesternBlotting試驗(yàn)，在2-DE參考凝膠上挖取MG組特異顯色點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶切，對(duì)所得多肽混合物進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，得到PMF數(shù)據(jù)，登陸http：//prospector.ucs

3、f.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm網(wǎng)站，用MSFit程序在NCBInr.10.13.2004數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定蛋白質(zhì)。 結(jié)果 (1)采用樣品裂解液Ⅰ提取胸腺組織蛋白質(zhì)，使用PDQuest7.1.1軟件對(duì)不同時(shí)間獲得的銀染凝膠圖譜中相同的蛋白點(diǎn)進(jìn)行匹配，能夠匹配的蛋白點(diǎn)為497個(gè)，匹配率為82.1％； (2)采用樣品裂解液Ⅰ一步法提取胸腺組織蛋白質(zhì)得到考凝膠圖像有蛋白質(zhì)點(diǎn)326個(gè)，而分別采用樣品裂

4、解液Ⅱ和Ⅰ的兩步法則可檢測(cè)到562個(gè)蛋白點(diǎn)； (3)三份樣品共12幅凝膠圖像的對(duì)比，共獲得明顯存在于各個(gè)凝膠的三個(gè)標(biāo)志蛋白點(diǎn)，分子量和等電點(diǎn)分別為：A點(diǎn)82.7KD7.0、B點(diǎn)50.7KD5.76和C點(diǎn)33.3KD5.02； (4)WesternBlotting試驗(yàn)共獲得5個(gè)MG特異顯色點(diǎn)，編號(hào)為2、4、6、7、9； (5)經(jīng)質(zhì)譜分析得到5個(gè)蛋白質(zhì)PMF圖譜，數(shù)據(jù)庫檢索這些蛋白分別為：2號(hào)蛋白點(diǎn)isopeptid

5、aseT、4號(hào)蛋白點(diǎn)importinbetasubunit和6號(hào)蛋白點(diǎn)SOULprotein。7號(hào)和9號(hào)蛋白點(diǎn)未能得到確認(rèn)，需要更換檢索條件或進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序才能進(jìn)一步認(rèn)定。 結(jié)論 (1)建立了MG胸腺組織蛋白質(zhì)提取的方法。采用由樣品裂解液Ⅰ和Ⅱ組成的兩步法提取胸腺組織蛋白質(zhì)可以獲得更為完整的MG胸腺組織蛋白2-DE圖像。 (2)通過對(duì)試驗(yàn)條件的優(yōu)化處理，獲得MG胸腺組織蛋白雙向電泳凝膠圖像，初步建立了MG胸腺組織