異丙酚抗炎作用的分子機(jī)制研究-Annexin A1與p38MAPK.pdf

1、1、研究背景和目的：
　　 內(nèi)毒素血癥是臨床上最為常見的一種全身炎癥反應(yīng)，創(chuàng)傷、感染、免疫機(jī)能下降、胃腸道粘膜缺血、甚至機(jī)械通氣等都能導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。而在外科手術(shù)的圍術(shù)期，內(nèi)毒素血癥的發(fā)生更是尤為常見，如果不能及時(shí)很好地干預(yù)與處理，術(shù)后所導(dǎo)致的急性腎損傷、肺損傷、甚至多器官功能障礙綜合癥（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS），常常是導(dǎo)致病人死亡的重要因素。因此在手術(shù)中如何能有效地降低

2、以及抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，以利于病人的術(shù)后康復(fù)，一直以來(lái)都是臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)問題。
　　 異丙酚(propofol)，又名丙泊酚，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型靜脈麻醉藥，化學(xué)名為2，6-雙異丙基酚（2，6-di-isopropylphenol），與巴比妥、丁香酚類、氯胺酮及甾體類等麻醉藥物不同。它既可以作為麻醉誘導(dǎo)劑又可以作為靜注全麻劑。異丙酚具有作用迅速、維持時(shí)間短，體內(nèi)無(wú)蓄積、毒性小而有一定鎮(zhèn)痛作用等優(yōu)點(diǎn)已廣泛用于臨床和ICU鎮(zhèn)靜。近

3、年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可降低肺動(dòng)脈壓及抑制缺血性肺血管收縮反應(yīng)，減輕右心負(fù)荷，同時(shí)還可抑制鈣離子內(nèi)流及釋放，因此可望對(duì)缺氧器官具有保護(hù)作用。此外最受人們關(guān)注的就是異丙酚的抗炎，保護(hù)效應(yīng)。從1992年O'Donnell等人報(bào)道臨床劑量范圍內(nèi)的異丙酚在體外能夠抑制中性粒細(xì)胞的極化（neutrophilpolarization），并呈一定的劑量依賴性后，異丙酚與炎癥反應(yīng)的關(guān)系研究一直是異丙酚研究的一個(gè)重點(diǎn)方向。盡管目前對(duì)異丙酚抑制炎癥反應(yīng)的功

4、能具有比較統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，然而對(duì)于這一功能的具體分子機(jī)制目前并不清楚，更不可能形成一套完整的理論基礎(chǔ)來(lái)指導(dǎo)臨床實(shí)踐，這也大大限制了異丙酚在炎癥反應(yīng)這一領(lǐng)域的具體應(yīng)用。
　　 近來(lái)研究表明異丙酚可以通過(guò)抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的多種不同分子來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，異丙酚可以增強(qiáng)TLR-4蛋白的下調(diào)，抑制CD14基因的表達(dá)及IkB的磷酸化，減少NF-kB向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而減少血漿和組織中的細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α、IL-8等。異丙酚還可通過(guò)

5、抑制參與炎癥反應(yīng)的相關(guān)粘附分子和降低微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，起到保護(hù)組織細(xì)胞的功能。Corcoran，T.B.等證明異丙酚可抑制由于氧化損傷引起的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上血管細(xì)胞粘附分子-1(vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1)及細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)表達(dá)的增加，并首次通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明異丙酚可抑制P-選擇素在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)，阻礙白

6、細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，并認(rèn)為異丙酚對(duì)P-選擇素的抑制作用，在心肌再灌注手術(shù)如心臟移植及冠脈搭橋手術(shù)中對(duì)心肌起到保護(hù)作用。
　　 研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素血癥中，異丙酚能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶(MitogenActivatedProteinKinase，MAPK)的激活、炎癥因子的釋放、NO的生成以及細(xì)胞骨架通透性的改變[23,24]。但對(duì)于異丙酚如何抑制MAPK的激活以及炎癥因子的釋放的具體分子作用機(jī)制并不清楚。為了進(jìn)一步研究異丙酚在內(nèi)

7、毒素血中抗炎的具體分子作用機(jī)制，我們前期構(gòu)建了內(nèi)毒素血癥大鼠模型，采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析異丙酚對(duì)大鼠血清和單個(gè)核細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的影響。通過(guò)對(duì)正常對(duì)照組大鼠、內(nèi)毒素血癥組大鼠以及內(nèi)毒素血癥聯(lián)合異丙酚處理組大鼠單個(gè)核細(xì)胞蛋白表達(dá)譜改變的深入研究，發(fā)現(xiàn)異丙酚能夠促進(jìn)單個(gè)核細(xì)胞中AnnexinA1的表達(dá)。但現(xiàn)在的問題是:(1)異丙酚對(duì)p38磷酸化的抑制是否就是因?yàn)锳nnexinA1的表達(dá)增高所直接引起？(2)如果異丙酚直接是通過(guò)Annexin

8、A1而抑制了p38的磷酸化，那么IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子的釋放在這一模型中是否就是直接受p38磷酸化的調(diào)控？(3)除了p38以外，在這一炎癥模型中異丙酚對(duì)MAPK炎癥信號(hào)通路中的ERK、JNK信號(hào)通路是否也有一定影響，這種影響是否也是與AnnexinA1有關(guān)？
　　 2、方法：
　　 2.1第一部分:
　　 2.1.1異丙酚對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠血清單核細(xì)胞中AnnexinA1和p38表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)隨機(jī)

9、分為6組:正常對(duì)照組（C組）、內(nèi)毒素血癥模型組（L組）、異丙酚組（P組）、LPS刺激+異丙酚處理組（L+P組）、脂肪乳組（I組）和LPS刺激+脂肪乳處理組（L+I組），每組6只大鼠。處理6h后取各組大鼠血清，分離單核細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取蛋白，westernblot檢測(cè)每組AnnexinA1和p-p38的表達(dá)情況。
　　 2.1.2異丙酚對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的釋放情況:實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為6組:正常對(duì)

10、照組（C組）、內(nèi)毒素血癥模型組（L組）、異丙酚組（P組）、LPS刺激+異丙酚處理組（L+P組）、脂肪乳組（I組）和LPS刺激+脂肪乳處理組（L+I組），每組6只大鼠。處理6h后取各組大鼠血清，采用ELASA法分別檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。
　　 2.2第二部分:
　　 2.2.1不同異丙酚濃度對(duì)AnnexinA1表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分為六組:C組:正常對(duì)照組;L組:LPS10μg/ml刺激6h組;L+P(5)

11、組:LPS10μg/ml加異丙酚5μg/ml刺激6h組;L+P(10)組:LPS10μg/ml加異丙酚10μg/ml刺激6h組;L+P(20)組:LPS10μg/ml加異丙酚20μg/ml刺激6h組;L+P(30)組:LPS10μg/ml加異丙酚30μg/ml刺激6h組;L+P(50)組:LPS10μg/ml加異丙酚50μg/ml刺激6h組。刺激6h后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取蛋白，westernblot檢測(cè)AnnexinA1的表達(dá)情況。<

12、br>　　 2.2.2異丙酚對(duì)LPS刺激THP-1下AnnexinA1表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)分為四組:C組:正常對(duì)照組;L組:LPS10μg/ml刺激組;L+P組:LPS10μg/ml加異丙酚20μg/ml刺激組;P組:異丙酚20μg/ml刺激組。分別刺激1h、2h、6h后收集細(xì)胞。Westernblot檢測(cè)AnnexinA1蛋白表達(dá)。
　　 2.2.3異丙酚對(duì)LPS刺激THP-1下MAPK家族激活的時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)分為四組:C組:正

13、常對(duì)照組;L組:LPS10μg/ml刺激組;L+P組:LPS10μg/ml加異丙酚20μg/ml刺激組;P組:異丙酚20μg/ml刺激組。分別刺激0.5h、1h、2h、6h后收集細(xì)胞。Westernblot檢測(cè)p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表達(dá)。
　　 2.2.4異丙酚對(duì)LPS刺激THP-1下炎癥因子的釋放情況實(shí)驗(yàn)分為四組:C組:正常對(duì)照組;L組:LPS10μg/ml刺激組;L+P組:LPS10μg/ml加異

14、丙酚20μg/ml刺激組;P組:異丙酚20μg/ml刺激組。采用ELASA法分別檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。
　　 2.2.5脂肪乳對(duì)LPS刺激THP-1下AnnexinA1和p-p38表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分為六組:C組:正常對(duì)照組;L組:LPS10μg/ml刺激6h組;L+I組:LPS10μg/ml加脂肪乳20μg/ml刺激6h組;I組:脂肪乳20μg/ml刺激6h組。收集細(xì)胞，Westernblot檢

15、測(cè)AnnexinA1和p-p38蛋白表達(dá)。
　　 2.2.6siRNA-AnnexinA1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞采用電穿孔的方法將已合成的siRNA-AnnexinA1轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞中。
　　 2.2.7siRNA-AnnexinA1轉(zhuǎn)染效率及干擾效率的檢測(cè)采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;RT-PCR法檢測(cè)AnnexinA1表達(dá)情況確認(rèn)干擾效率。
　　 2.2.8AnneinxA1沉默后異丙酚對(duì)p-p38表達(dá)的

16、影響實(shí)驗(yàn)分為四組:L組:LPS10μg/ml刺激6h組;L+P組:LPS10μg/ml加異丙酚20μg/ml刺激6h組;P組:異丙酚20μg/ml刺激6h組;L’組:轉(zhuǎn)染siRNA-AnnexinA1后給予LPS10μg/ml刺激6h組;L’+P’組:轉(zhuǎn)染siRNA-AnnexinA1后給予LPS10μg/ml加異丙酚20μg/ml刺激6h組。收集細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)AnnexinA1和p-p38蛋白表達(dá)。
　　 2

17、.2.9AnneinxA1沉默后異丙酚對(duì)炎癥因子釋放的影響實(shí)驗(yàn)分為四組:L組:LPS10μg/ml刺激6h組;L+P組:LPS10μg/ml加異丙酚20μg/ml刺激6h組;P組:異丙酚20μg/ml刺激6h組;L'組:轉(zhuǎn)染siRNA-AnnexinA1后給予LPS10μg/ml刺激6h組;L'+P’組:轉(zhuǎn)染siRNA-AnnexinA1后給予LPS10μg/ml加異丙酚20μg/ml刺激6h組。收集細(xì)胞，采用RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)

18、胞中TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表達(dá)水平。
　　 3、結(jié)果：
　　 3.1第一部分:
　　 3.1.1異丙酚對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠血清單核細(xì)胞中AnnexinA1和p38表達(dá)的影響結(jié)果顯示:與L組相比，P組和L+P組AnnexinA1的表達(dá)量明顯增高(P＜0.01)，而I組和I+L組無(wú)差異;與C組相比，L組、L+P組和L+I組的p38磷酸化水平顯著增加（P＜0.01）;與L組相比，L+P組p38磷酸化水平

19、明顯降低(P＜0.01)，而L+I組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.12異丙酚對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的影響與C組相比，L組、L+P組和L+I組IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明顯增高(P＜0.01）;與P組相比，L+P組IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明顯增高(P＜0.01);與I組相比，L+I組IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明顯增高(P＜0.01);與L組相比，L+P組

20、大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均顯著降低(P＜0.01)，而L+I組無(wú)差異。
　　 3.2第二部分:
　　 3.2.1不同異丙酚濃度對(duì)AnnexinA1表達(dá)的影響隨著異丙酚濃度的增加，AnnexinA1的表達(dá)依次增加，當(dāng)異丙酚濃度為30μg/ml時(shí)，對(duì)AnnexinA1的激活達(dá)到最大效應(yīng)，當(dāng)異丙酚濃度為50μg/ml時(shí)，AnnexinA1的表達(dá)減少，異丙酚濃度為20μg/ml時(shí)，對(duì)AnnexinA1的激

21、活與30μg/ml比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 3.2.2異丙酚對(duì)LPS刺激THP-1下AnnexinA1表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)在異丙酚刺激1h和2h時(shí)，與L組相比，L+P組和P組AnnexinA1表達(dá)均無(wú)差異;在刺激6h時(shí)，與L組相比，L+P組和P組AnnexinA1表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。
　　 3.2.3異丙酚對(duì)LPS刺激THP-1下MAPK家族的影響與C組相比，L組p38磷酸化水平顯著增高(P＜0.01

22、)，P組無(wú)明顯變化;與L組相比，L+P組的p38磷酸化水平在0.5h處無(wú)顯著變化，從1h開始降低，2h、6h顯著降低(P＜0.01)，并呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。
　　 在0.5h和1h時(shí)，與C組相比，L組ERK1/2磷酸化水平明顯增高(P＜0.01)，2h和6h時(shí)兩組則無(wú)顯著差異;僅在異丙酚刺激1h時(shí)，L+P組ERK1/2磷酸化水平顯著低于L組(P＜0.01)。
　　 與C組相比，L組JNK1/2磷酸化水平明顯增高(P＜0.01)

23、，與L組相比，L+P組JNK1/2磷酸化水平無(wú)明顯差異。
　　 3.2.4異丙酚對(duì)LPS刺激THP-1下炎癥因子釋放的影響與C組相比，L組、L+P組IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明顯增高(P＜0.01);與P組相比，L+P組IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明顯增高(P＜0.01）;與L組相比，L+P組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均顯著降低(P＜0.01)。
　　 3.2.5脂肪乳對(duì)L

24、PS刺激THP-1下AnnexinA1和p-p38表達(dá)的影響C組、L組、I組、L+I組對(duì)AnnexinA1表達(dá)均無(wú)顯著差異(P＞0.05);對(duì)于p-p38的表達(dá)，與C組相比，L組和L+I組p38磷酸化水平顯著增加(P＜0.01)，I組無(wú)明顯差異;與L組，L+I組p38磷酸化水平無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 3.2.6AnnexinA1轉(zhuǎn)染效率和干擾效率轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)60％左右;與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了siRNA-Annexin

25、A1的細(xì)胞中AnnexinA1mRNA的表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，其干擾效率可達(dá)75％。
　　 3.2.7AnneinxA1沉默后異丙酚對(duì)p-p38表達(dá)的影響在野生型中，與L組相比，L+P組p38磷酸化水平顯著下降(P＜0.01)，在AnnexinA1-/-細(xì)胞中，L組與L+P組p38磷酸化水平表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　 3.2.8AnneinxA1沉默后異丙酚對(duì)炎癥因子釋放的影響與L組相比，L+P組IL

26、-1β、IL-6、TNF-α的釋放明顯減少(P＜0.01);與L’組相比，L’+P’組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　 4、結(jié)論：
　　 (1)整體水平證明了異丙酚可上調(diào)AnnexinA1的表達(dá)，抑制p38MAPK磷酸化，最終抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放達(dá)到抗炎作用.
　　 (2)細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)證明異丙酚對(duì)AnnexinA1蛋白的激活呈一定的濃度

27、依賴性，當(dāng)異丙酚濃度為30μg/ml時(shí)，對(duì)AnnexinA1的激活達(dá)到最大效應(yīng)，當(dāng)異丙酚濃度為50μg/ml時(shí)，AnnexinA1的表達(dá)減少。
　　 (3)異丙酚對(duì)MAPK家族的影響:LPS刺激THP-1細(xì)胞可促進(jìn)p38MAPK、ERK1/2及JNK1/2的磷酸化，異丙酚干預(yù)后可通過(guò)抑制p38MAPK及ERK1/2的磷酸化發(fā)揮抗炎作用，但與JNK1/2的磷酸化無(wú)明顯相關(guān)性。
　　 (4)異丙酚可通過(guò)上調(diào)THP-1細(xì)胞中A