Wnt7a基因?qū)Υ笫蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化影響的研究.pdf

1、研究背景:
　　目前,脊髓損傷后治療依然存在重重困難,主要是神經(jīng)組織自身修復(fù)能力有限。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞可以作為種子細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)組織,然而其來源有限,并且其獲取受倫理道德的制約。近年來,具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于易于獲取而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞移植損傷修復(fù),但是脊髓損傷區(qū)營(yíng)養(yǎng)因子分泌缺乏、誘導(dǎo)環(huán)境條件不足,導(dǎo)致修復(fù)效果不理想。因此,保持MSCs的長(zhǎng)期存

2、活、提高其向神經(jīng)元細(xì)胞分化率非常重要。
　　wnt家族在腫瘤、肌肉再生、神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)、生殖系統(tǒng)、肢干背腹形成和后肢發(fā)育、軟骨與眼角膜修復(fù)、心臟發(fā)育方面均發(fā)揮重要作用。Wnt7a是wnt家族的重要成員之一。研究證明,更新的衛(wèi)星干細(xì)胞中wnt7a表達(dá)上調(diào),Wnt7a能夠刺激衛(wèi)星干細(xì)胞的對(duì)稱延伸,促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞和衛(wèi)星干細(xì)胞的增殖。在創(chuàng)傷角膜中,LyuJ等[1]發(fā)現(xiàn)Wnt7a表達(dá)能夠迅速被誘導(dǎo),并啟動(dòng)角膜上皮細(xì)胞的增殖,從而增強(qiáng)創(chuàng)傷愈合。同

3、時(shí),wnt7a在神經(jīng)發(fā)展、軸突和突觸生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用。Ciani和其他學(xué)者[2-4]初步研究發(fā)現(xiàn)Wnt7a能夠誘導(dǎo)軸突延伸和分支,對(duì)促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化有重要作用。因此,我們推斷Wnt7a在組織修復(fù)中可能具有重要作用。
　　研究目的:
　　1.構(gòu)建Wnt7a腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MSCs,研究Wnt7a過表達(dá)對(duì)MSCs增殖的影響及機(jī)制。
　　2.研究Wnt7a過表達(dá)對(duì)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響,以期為

4、臨床應(yīng)用MSCs治療脊髓損傷提供初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.采用密度梯度離心法并聯(lián)合貼壁培養(yǎng)進(jìn)行SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記分子,通過成骨誘導(dǎo)分化進(jìn)行鑒定。
　　2.通過PCR方法克隆Wnt7a基因,通過同源重組構(gòu)建腺病毒表達(dá)質(zhì)粒,通過PCR進(jìn)行陽性克隆鑒定,并通過測(cè)序鑒定篩選出的陽性克隆,利用Western blot檢測(cè)Wnt7a基因表達(dá)。在大腸桿菌中擴(kuò)增陽性克隆質(zhì)粒和

5、腺病毒輔助質(zhì)粒,然后在293T細(xì)胞中進(jìn)行同源重組進(jìn)行病毒包裝。通過CsCl密度梯度離心進(jìn)行病毒的純化,然后通過試劑測(cè)定病毒的滴度。
　　3.將大鼠骨髓間充干細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板,按MOI=60、80、100進(jìn)行腺病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)。
　　4.將MSCs細(xì)胞鋪到24孔板,16h后按MOI=80感染W(wǎng)nt7a腺病毒和對(duì)照腺病毒,感染后觀察熒光情況,利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
　　5.Western blot檢測(cè)Wnt7a

6、表達(dá)腺病毒感染MSCs后Wnt7a、β-catenin和CyclinD1的表達(dá)。
　　6.MSCs細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo),將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成3組:MSCs組、MSCs+對(duì)照病毒組、MSCs+Wnt7a腺病毒組,每孔加入1mLDMEM/低糖+10ng/mLbFGF培養(yǎng)過夜,換液后每孔加入1mLDMEM/低糖+200μmol/LBHA液,誘導(dǎo)5h,吸走誘導(dǎo)液,加入300μL/孔的4％多聚甲醛固定25min,免疫熒光檢測(cè)MSCs細(xì)胞向神經(jīng)元

7、樣細(xì)胞誘導(dǎo)后NSE蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.MSCs細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,貼壁生長(zhǎng),呈長(zhǎng)梭形;細(xì)胞表面CD34、CD45陰性表達(dá),CD44、CD90陽性表達(dá)。成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色見鈣顆粒。
　　2.通過PCR方法克隆Wnt7a基因獲得1085bp片段,與NCBIgenebank中片段大小基本相符。通過PCR陽性克隆鑒定和測(cè)序證明構(gòu)建的腺病毒表達(dá)質(zhì)粒完全正確。Western blot檢測(cè)Wnt7a表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293

8、T細(xì)胞后的表達(dá),在72KD處有陽性條帶,其大小和Wnt7a-GFP-Flag融合蛋白(69KD)相吻合。通過試劑盒測(cè)定對(duì)照腺病毒的滴度是7.8×1010vp/mL,Wnt7a過表達(dá)病毒的滴度是1.3×1010vp/mL。
　　3.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的對(duì)照腺病毒在MOI=80時(shí)感染效果最好,Wnt7a過表達(dá)病毒在MOI=100時(shí)感染效果最好。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在第1、2天,MSCs+Wnt7a腺病毒組細(xì)胞OD

9、(570)值與MSCs+對(duì)照腺病毒組細(xì)胞、MSCs組細(xì)胞相比均沒有差異,MSCs+對(duì)照腺病毒組細(xì)胞和MSCs組細(xì)胞相比也沒有差異。在第3、4天,MSCs+Wnt7a腺病毒組細(xì)胞D(570)值與MSCs+對(duì)照腺病毒組細(xì)胞、MSCs組細(xì)胞相比均有差異(P<0.05)。在第5天,MSCs+Wnt7a腺病毒組細(xì)胞D(570)值與MSCs+對(duì)照腺病毒組細(xì)胞、MSCs組細(xì)胞相比均有差異(P<0.01)。說明,在第1、2天,MSCs感染W(wǎng)nt7a腺病

10、毒組細(xì)胞增殖速度與感染對(duì)照腺病毒組細(xì)胞、MSCs組細(xì)胞沒有明顯差異;在第3~5天,MSCs感染W(wǎng)nt7a腺病毒組細(xì)胞增殖速度與感染對(duì)照腺病毒組細(xì)胞、MSC組細(xì)胞有明顯差異。
　　5.Wnt7a腺病毒感染大鼠MSCs后,CyclinD1蛋白、細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白和細(xì)胞核中β-catenin蛋白表達(dá)與感染對(duì)照病毒的MSCs組相比分別增加2.1、1.5、1.7倍,均有顯著差異(P<0.05);感染對(duì)照病毒的MSCs與單純的MS

11、Cs相比上述蛋白的表達(dá)沒有差異(P>0.05)。
　　6.MSCs細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo),將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成3組:MSCs組、MSCs+對(duì)照病毒組、MSCs+Wnt7a腺病毒組,3組細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后均可見神經(jīng)元標(biāo)記蛋白NSE的表達(dá)(圖8),但是3組的誘導(dǎo)分化率不同,單純的MSCs組細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)率在45%左右,感染對(duì)照腺病毒MSCs細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)率在40%左右,感染W(wǎng)nt7a腺病毒MSCs組細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)率在67

12、%左右。感染W(wǎng)nt7a腺病毒MSCs組細(xì)胞與感染對(duì)照腺病毒MSCs細(xì)胞相比存在明顯差異(P<0.05),感染對(duì)照組腺病毒MSCs細(xì)胞與純MSCs組細(xì)胞相比沒有差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過密度梯度離心貼壁培養(yǎng)法成功的培養(yǎng)出大鼠MSCs細(xì)胞,且細(xì)胞增殖良好,此方法操作簡(jiǎn)單;通過CD34、CD45陰性表達(dá),CD44、CD90陽性表達(dá)和成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色見鈣顆粒可以判定獲得的細(xì)胞為MSCs。
　　2.

13、通過PCR陽性克隆鑒定、測(cè)序、Western blot及滴度鑒定實(shí)驗(yàn)證明腺病毒構(gòu)建成功。
　　3.對(duì)照腺病毒在MOI=80時(shí)感染效果最好,Wnt7a過表達(dá)病毒在MOI=100時(shí)感染效果最好,后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照此MOI值進(jìn)行。
　　4.Wnt7a對(duì)大鼠MSCs有明顯的促進(jìn)作用。
　　5.Wnt7a蛋白過表達(dá)后提高CyclinD1蛋白、細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白和細(xì)胞核中β-catenin蛋白表達(dá),可能激活了經(jīng)典的Wnt/β