干細胞體外誘導為類毛細胞的實驗研究.pdf

1、第一部分神經干細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及標記 目的：神經干細胞(NSC)的研究已逐漸成為國內、外基礎及臨床醫(yī)學各專業(yè)的重要研究課題。利用NSC進行細胞治療或基因治療有很好的臨床應用前景。本實驗旨在建立一種較為簡便、可靠的豚鼠NSC分離、培養(yǎng)、標記方法，為耳科學領域NSC的進一步深入研究提供幫助。 材料與方法：分離新生豚鼠海馬組織進行NSC的原代、傳代培養(yǎng)及誘導分化培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征，培養(yǎng)的細胞行Nest

2、in免疫細胞化學,WesternBlot檢測，對誘導細胞行NSE、GFAP免疫熒光化學觀察，以鑒定所培養(yǎng)的細胞為NSC；用熒光染料DAPI標記干細胞，計算原代及傳代標記率。 結果：1.原代培養(yǎng)見細胞呈大小不一、懸浮生長的細胞團，邊界清晰，細胞團中細胞排列較為致密。光鏡下傳代培養(yǎng)的細胞形態(tài)特點與原代培養(yǎng)無明顯差異。2．原代及傳代培養(yǎng)的細胞團Nestin陽性表達，誘導分化后的細胞NSE、GFAP陽性表達。3.經熒光染料DAPI標記后

3、，標記成功率可達93.4％，經傳代8次后熒光標記可傳入子代細胞，其熒光亮度無明顯衰減。 結論：1．本研究從新生豚鼠海馬組織中分離、培養(yǎng)的細胞為NSCs。2．DAPI標記活細胞具有對細胞損傷小，標記效率高，可長期觀察的優(yōu)點。 第二部分人工外淋巴液誘導神經干細胞的分化 目的：本研究使用不同濃度的人工外淋巴液體外模擬內耳微環(huán)境誘導神經干細胞分化，以期為進一步研究和使用神經干細胞移植內耳奠定基礎。 結論：1.神經

4、干細胞在胎牛血清和人工外淋巴液中均可以存活并分化出表達毛細胞特異抗體的細胞。2．鼠尾膠原有利于神經干細胞向類毛細胞分化。 第三部分不同配方生長因子對神經干細胞分化為類毛細胞的影響 目的：本研究以新生豚鼠海馬神經干細胞為對象，探討由堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)及腦衍生神經營養(yǎng)因子(BDNF)所組成的不同配方對誘導神經干細胞分化的影響，旨在尋求最適合神經干細胞向類毛細胞方向分化的培養(yǎng)條件。

5、 結論：bFGF、EGF、BDNF均能誘導神經干細胞向類毛細胞方向分化，但以bFGF+EGF及bFGF+EGF+BDNF協同作用為佳。 第四部分豚鼠脂肪干細胞向類毛細胞的誘導分化 目的：本研究進一步完善了豚鼠脂肪干細胞(ADSCs)分離方法，并對脂肪干細胞體外加以誘導分化為類毛細胞，希望為下一步脂肪干細胞移植入內耳提供理論依據。 結果：1．豚鼠脂肪干細胞呈現梭形或多角形生長。2．MTT檢測表明培養(yǎng)的ADSCs具