人TLR4胞外段的真核表達(dá)及其對(duì)LPS所致炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷、大手術(shù)后及其他危重病人往往伴有嚴(yán)重的革蘭氏陰性菌感染，最終可發(fā)展為內(nèi)毒素血癥，甚至內(nèi)毒素休克，是目前危重癥治療領(lǐng)域非常棘手的問(wèn)題。革蘭氏陰性菌的致病物質(zhì)基礎(chǔ)是被稱為內(nèi)毒素的脂多糖(LPS)，近年研究證明，LPS主要通過(guò)一種跨膜蛋白Toll-likereceptor4(TLR4)將炎癥信號(hào)傳入胞內(nèi)，進(jìn)一步激發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。若能在TLR4水平阻斷該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，那么就有可能抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)。基于此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)真核系統(tǒng)表達(dá)TL

2、R4胞外段，并觀察它對(duì)LPS所致炎癥反應(yīng)的影響。 方法：首先通過(guò)PCR技術(shù)從攜帶TLR4全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pCMV-TLR4上擴(kuò)增獲得TLR4胞外段cDNA，將后者克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-eTLR4，通過(guò)酶切分析及測(cè)序給予鑒定。然后將pcDNA3.1(+)-eTLR4通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，在mRNA水平觀察TLR4胞外基因的表達(dá)。最后我們用G418篩選穩(wěn)定

3、表達(dá)TLR4胞外段HEK293細(xì)胞，用培養(yǎng)液上清作用于誘導(dǎo)分化成熟的U937細(xì)胞，通過(guò)ELISA觀察該細(xì)胞TNF-α的分泌變化。 結(jié)果：1.從攜帶TLR4全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pCMV-TLR4上成功擴(kuò)增獲得TLR4胞外段cDNA，片段大小1.8kb，與理論值一致。2.將TLR4胞外段cDNA克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，通過(guò)酶切分析及測(cè)序證明成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒cDNA3.1(+)-eTLR4，其插入片段的堿基序列、

4、兩端的酶切位點(diǎn)及讀碼框完全正確。3.通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pcDNA3.1(+)-eTLR4和pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，在mRNA水平證明：前者有TLR4胞外基因表達(dá)，而后者無(wú)任何表達(dá)。4.LPS能刺激誘導(dǎo)分化成熟的U937細(xì)胞TNF-α的分泌量增加(p＜0.01)，其分泌量隨LPS劑量增加而增加。5.穩(wěn)定表達(dá)TLR4胞外段的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液上清能減少誘導(dǎo)分化成熟的U937細(xì)胞TNF-α的分泌量(p＜0.01

5、)，并隨劑量增加而降低；而穩(wěn)定表達(dá)TLR4胞外段的HEK293細(xì)胞裂解液對(duì)TNF-α的分泌無(wú)明顯影響；同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞培養(yǎng)液上清對(duì)TNF-α的分泌亦無(wú)明顯影響。6.細(xì)胞培養(yǎng)液上清在不同時(shí)刻給予，對(duì)誘導(dǎo)分化成熟的U937細(xì)胞TNF-α的分泌量有所影響，隨給藥時(shí)間延遲TNF-α的分泌量有逐漸降低的趨勢(shì)。 結(jié)論：構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-eTLR4能在HEK293細(xì)胞中獲得表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白人TLR4胞外段能與誘