Bnip3與大鼠糖尿病心肌損害相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究目的和背景： 長(zhǎng)期以來(lái)早就認(rèn)識(shí)到糖尿病心血管尤其是大血管并發(fā)癥是糖尿病致死致殘的主要原因，合并糖尿病心血管疾病的患者死亡率是無(wú)糖尿病史患者的2-4倍。早期診斷和治療糖尿病心血疾病對(duì)糖尿病的三級(jí)預(yù)防有著重大意義。為此，本課題組致力尋找與糖尿病大血管并發(fā)癥發(fā)病早期相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，并研究其相關(guān)機(jī)制和功能。在先期的研究中，我們成功建立了大鼠2型糖尿病心肌損害的模型，并應(yīng)用熒光標(biāo)記差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(DifferentialD

2、isplayReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，DDRT-PCR)技術(shù)，篩選糖尿病早期大鼠心肌與正常對(duì)照鼠之間基因的差異表達(dá)。在比對(duì)表達(dá)譜過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)并克隆了還未命名的與小鼠和人Bnip3序列高度相似的新基因序列：2ass-Bnip3，一年后在參考我們以及其他實(shí)驗(yàn)室所提供的序列后，大鼠Bnip3DNA序列正式公布。Bnip3(Bcl-2/adenovirusE1B19kDa-int

3、eractingprotein3)本質(zhì)為隸屬于Bcl2(B-celllymphoma-2)家族的一類線粒體促凋亡蛋白，因其僅含BH3(Bd2homology3，Bcl2同源結(jié)構(gòu)域3)結(jié)構(gòu)域，故亦為BH3家族成員。有關(guān)該基因的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：其細(xì)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)為線粒體外膜，不同于其他BH3超家族成員，Bnip3可不依賴其他Bcl2蛋白直接介導(dǎo)細(xì)胞線粒體功能損害乃至細(xì)胞凋亡。目前有關(guān)Bnip3和心肌功能障礙關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)：其功能過(guò)度活躍可能是

4、介導(dǎo)心肌缺血缺氧及缺氧再灌注后心肌細(xì)胞凋亡和重塑重要機(jī)制之一。 糖尿病心肌病獨(dú)立于血管、瓣膜損害所致心肌病，目前對(duì)其的主要認(rèn)識(shí)為：它是由糖尿病狀態(tài)所致的一種心臟疾病，功能上定義為心室擴(kuò)張，心肌細(xì)胞肥大，顯著心肌間質(zhì)纖維化，舒張功能障礙伴或不伴收縮功能障礙。該概念確立數(shù)十年來(lái)，至今仍對(duì)糖尿病導(dǎo)致心肌損害的病理生理機(jī)制所知甚少。而我們先期研究發(fā)現(xiàn)Bnip3表達(dá)上調(diào)和糖尿病心肌損害存在一定的關(guān)系，這促使我們進(jìn)行更深入的研究。通過(guò)借助制

5、備其特異性抗體；并在細(xì)胞模型中過(guò)度表達(dá)或干擾敲除該基因等技術(shù)，以期明確Bnip3是否為糖尿病心肌病可能的治療靶點(diǎn)，并初步探究其所參與的細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控途徑，及導(dǎo)致糖尿病心肌病損害的具體分子機(jī)制。 材料與方法： 運(yùn)用PCR和亞克隆技術(shù)，分別擴(kuò)增大鼠Bnip3全長(zhǎng)和△Bnip3(29-122aa)片段，并與原核表達(dá)載體PGEX4T2及真核表達(dá)載體PIRES2-EGFP連接。通過(guò)限制性雙酶切和DNA測(cè)序證實(shí)克隆序列為目的質(zhì)粒。調(diào)整

6、孵育溫度，時(shí)間和IPTG濃度，摸索最佳原核蛋白表達(dá)條件。運(yùn)用GST親和柱純化GST融合蛋白;經(jīng)蛋白測(cè)序，確證為大鼠Bnip3蛋白片段后，免疫新西蘭大白兔，經(jīng)多次免疫增強(qiáng)后制備兔抗大鼠Bnip3多克隆抗體。在建立原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，真核表達(dá)載體以QiagenEffectene脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染入原代心肌細(xì)胞，用熒光顯微鏡，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。運(yùn)用Lipofectime2000轉(zhuǎn)染針對(duì)Bnip3的siRNA序列和上述真核表

7、達(dá)載體至H9c2細(xì)胞株內(nèi)，siRNAknockdownBnip3的表達(dá)，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞株，分別對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和下游細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用全反式維甲酸和去血清的方法對(duì)H9c2進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察Bnip3在這段時(shí)間內(nèi)的表達(dá)變化，用MitotrackRED標(biāo)記細(xì)胞線粒體，用Dihydroethidium超氧陰離子探針染色細(xì)胞，憑借不同波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度，以判斷超氧陰離子或內(nèi)源性過(guò)氧化物產(chǎn)生的量，采用AnnexinV抗體，用流式細(xì)

8、胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。采用Affymatrix大鼠基因表達(dá)譜芯片，分析高表達(dá)Bnip3心肌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的基因表達(dá)差異，運(yùn)用生物信息學(xué)進(jìn)行pathwaymining，Sybgreen實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1)成功制備兔抗大鼠Bnip3多克隆抗體2)獲得大鼠Bnip3的EGFP真核轉(zhuǎn)染載體； 3)獲得Bnip3轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的原代心肌細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的成心肌H9c2細(xì)胞株； 4)胚胎心肌

9、細(xì)胞株H9c2誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)及定量PCR結(jié)果顯示Bnip3可能參與心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程。 5)高糖除上調(diào)糖尿病大鼠動(dòng)物模型心肌Bnip3表達(dá)水平，亦可上調(diào)心肌細(xì)胞和H9c2細(xì)胞Bnip3的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)Bnip3可促使大部分Bnip3聚集于線粒體外膜，發(fā)揮其破壞線粒體電勢(shì)差作用。 6)過(guò)表達(dá)Bnip3又可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物生成增多，細(xì)胞凋亡增加：起著類似高糖對(duì)心肌細(xì)胞作用，并且兩者有相加作用。但在高糖情況下干擾Bn

10、ip3不能有效降低細(xì)胞凋亡率。 7)表達(dá)譜基因芯片技術(shù)研究Bnip3調(diào)控途徑發(fā)現(xiàn)：Bnip3可以調(diào)控心肌細(xì)胞能量代謝，線粒體功能，心肌纖維化，鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，心肌發(fā)育和損害重塑以及炎癥因子等多種心肌損害途徑的關(guān)鍵基因。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，確認(rèn)在所篩查的15個(gè)候選基因中CPT-1b，COX8H，CKB，MMP9，XDTH，CXCL10，Glut4，CPN6，MMP9，VCAM1的表達(dá)與基因芯片結(jié)果一致，其中siRNA干擾實(shí)驗(yàn)證明CPT

11、-1b，COX8H，CKB，MMP9受Bnip3的雙向調(diào)控。 結(jié)論： Bnip3在糖尿病早期動(dòng)物模型的心肌組織中上調(diào)，對(duì)糖尿病心肌病的發(fā)生有著重要意義。它通過(guò)上調(diào)多個(gè)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及β-氧化相關(guān)基因(CPT-1b，CD36，Acsll)，下調(diào)CKB表達(dá)，促使心肌細(xì)胞能量代謝底物更局限于脂肪酸氧化，促進(jìn)心肌細(xì)胞糖脂毒性發(fā)生，同時(shí)降低心肌能量?jī)?chǔ)備，參與調(diào)節(jié)心肌能量代謝紊亂的調(diào)節(jié)。Bnip3亦可能通過(guò)上調(diào)氧化應(yīng)激和線粒體呼吸相關(guān)基

12、因XDH和COXSH，協(xié)同上述其促進(jìn)心肌脂肪酸氧化代謝途徑，及其直接影響線粒體跨膜電勢(shì)差等機(jī)制，介導(dǎo)高糖心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。而通過(guò)改變緩激肽釋放酶和緩激肽系統(tǒng)活性，金屬蛋白酶的表達(dá)，抑制Wnt系統(tǒng)抑制信號(hào)蛋白，Bnip3亦參與糖尿病心肌廣泛纖維化和心肌重塑的過(guò)程。加之Bnip3參與調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞炎癥因子表達(dá)上調(diào)，提示其對(duì)糖尿病心肌病發(fā)病的各個(gè)環(huán)節(jié)中均有作用，鑒于其在糖尿病大鼠模型的早期就已出現(xiàn)表達(dá)水平的改變，我們有理由認(rèn)為，Bnip3可