IP10，ITAC及其雙功能分子誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫及機(jī)制研究.pdf

1、本研究以小鼠4T1乳腺癌為模型，觀察改變IP10或ITAC的表達(dá)對(duì)4T1腫瘤生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制。最后，根據(jù)趨化因子功能特點(diǎn)，將趨化因子作用顯著的結(jié)構(gòu)域組合起來(lái)，構(gòu)建了功能更顯著的抗腫瘤分子，可能為趨化因子用于腫瘤的生物學(xué)防治提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1．IP10的抗腫瘤作用及其機(jī)制 構(gòu)建了pcDNA3—IP10真核表達(dá)質(zhì)粒。電穿孔的方法將質(zhì)粒導(dǎo)入4T1細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株4T1—IP10。雌性BALB/c小鼠及裸鼠皮

2、下接種4T1—IP10細(xì)胞后形成的腫瘤較對(duì)照組生長(zhǎng)緩慢，腫瘤較小，重量較輕，并且4T1—IP10荷瘤小鼠存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，在4T1—IP10腫瘤組織中IP10表達(dá)水平顯著上調(diào)。觀察了IP10對(duì)淋巴細(xì)胞在腫瘤局部浸潤(rùn)的影響，結(jié)果表明，單位重量的4T1—IP10腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的兩倍；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞在4T1—IP10腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)顯著增加；FACS分析腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的表型，結(jié)果顯示，4T1—I

3、P10腫瘤內(nèi)CXCR3+CD4+T和CXCR3+CD8+T細(xì)胞比例均較對(duì)照組增高。將4T1—IP10腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞分離出來(lái)，體外經(jīng)特異性刺激后，增殖應(yīng)答能力和特異性殺傷活性增強(qiáng)，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞IFN—γ分泌明顯增加。以上結(jié)果提示，募集并增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的效應(yīng)功能在IP10介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制中具有重要的作用。進(jìn)一步觀察了腫瘤局部IP10表達(dá)對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響。體外特異性刺激后，4T1—IP10荷瘤小鼠的脾細(xì)胞抗原特異性增殖應(yīng)

4、答能力及殺傷活性均較對(duì)照組顯著增高。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者常見(jiàn)的死亡原因，誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的策略之一。實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照比較，接種4T1—IP10的小鼠，經(jīng)尾靜脈注射4T1細(xì)胞后，大體標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn)，肺表面形成的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)顯著減少。4T1—IP10組小鼠肺重明顯減輕，肺組織內(nèi)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞形成的克隆顯著減少。肺組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，4T1—IP10組肺組織內(nèi)僅有小的單一轉(zhuǎn)移病灶，而對(duì)照組轉(zhuǎn)移灶較大并且可以形成多發(fā)的轉(zhuǎn)移病

5、灶。 以往研究表明IP10具有抗血管生成的作用，觀察了IP10抗血管效應(yīng)在IP10介導(dǎo)的4T1腫瘤生長(zhǎng)抑制中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨IP10濃度的增加，內(nèi)皮細(xì)胞增殖顯著受到抑制。劃痕實(shí)驗(yàn)表明，IP10能抑制bFGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的80％。研究表明，IP10能顯著抑制bFGF誘導(dǎo)的血管生成。將血管內(nèi)皮細(xì)胞在4T1—IP10腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，結(jié)果顯示，4T1—IP10腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能顯著延長(zhǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的

6、生長(zhǎng)周期，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。腫瘤組織H&E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，在4T1—IP10腫瘤局部可以看到血管閉塞現(xiàn)象及腫瘤局灶性壞死，而對(duì)照組血管密度高，并可以看到大的血管腔，提示IP10能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，抗腫瘤血管生成，使腫瘤局部缺血壞死，發(fā)揮抗腫瘤作用。 2．ITAC的抗腫瘤作用及其機(jī)制 通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的方法建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3—ITAC的4T1細(xì)胞。將4T1—ITAC細(xì)胞在小鼠皮下接種，觀察腫瘤生長(zhǎng)狀

7、況。結(jié)果顯示，在BALB/c小鼠及裸鼠體內(nèi)4T1—ITAC腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢，腫瘤較小并且重量較輕，荷瘤小鼠存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。但是在裸鼠體內(nèi)4T1—ITAC生長(zhǎng)抑制作用沒(méi)有在BALB/c小鼠體內(nèi)明顯。提示T細(xì)胞可能參與了ITAC介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，在4T1—ITAC腫瘤組織中ITAC表達(dá)水平顯著上調(diào)。為分析ITAC在腫瘤局部表達(dá)對(duì)腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，分離并計(jì)數(shù)了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示，單位重量的4T1—

8、ITAC腫瘤內(nèi)分離的淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加，是對(duì)照組的3倍。鑒于ITAC是CXCR3的配體，分析了CXCR3+淋巴細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的浸潤(rùn)情況。FACS分析表明，CXCR3+淋巴細(xì)胞比例在4T1—ITAC腫瘤顯著增高，并且在4T1—ITAC腫瘤內(nèi)CXCR3+CD4+T和CXCR3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例均高于對(duì)照組。分析了在腫瘤局部表達(dá)的ITAC對(duì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的效應(yīng)功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4T1—ITAC腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，體外經(jīng)4T1特異性刺激

9、后顯著增殖，殺傷活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。ELISPOT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4T1—ITAC腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞IFN—γ分泌增加。這些結(jié)果表明ITAC能促進(jìn)腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的效應(yīng)功能，可能是ITAC介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)抑制的機(jī)制之一。為進(jìn)一步確證ITAC的抗腫瘤效應(yīng)，檢測(cè)了荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果顯示，4T1—ITAC荷瘤小鼠的脾細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)明顯增強(qiáng)，對(duì)4T1細(xì)胞的特異性殺傷活性增高。利用實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型檢測(cè)了4T1-IT

10、AC荷瘤小鼠對(duì)4T1細(xì)胞在體內(nèi)播散轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果表明，接種4T1-ITAC腫瘤細(xì)胞的小鼠，其肺表面沒(méi)有明顯的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成，肺重明顯減輕。肺組織轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆形成顯著減少。肺組織H&E染色觀察發(fā)現(xiàn)，4T1-ITAC組未見(jiàn)明顯的轉(zhuǎn)移病灶形成。這些結(jié)果提示ITAC在腫瘤局部表達(dá)能保護(hù)小鼠，降低腫瘤播散轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。 檢測(cè)了ITAC的抗血管生成作用。劃痕實(shí)驗(yàn)表明ITAC能抑制bFGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的55％。MTT法檢測(cè)，隨ITA

11、C濃度的增加，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制效果不明顯。與4T1細(xì)胞培養(yǎng)上清比較，4T1-ITAC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但是與RPMI1640組比較沒(méi)有顯著差異。以上結(jié)果可能提示，ITAC具有一定的抗血管作用，并且參與了ITAC介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制，但不是主要的機(jī)制。 3．雙功能分子的設(shè)計(jì)及構(gòu)建 將先前的結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與IP10比較，ITAC具有較強(qiáng)的趨化作用及誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。結(jié)構(gòu)功能分析

12、表明，趨化因子的N端和N-LOOP區(qū)是結(jié)合及活化受體的關(guān)鍵部位，而趨化因子的C端可以結(jié)合在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，發(fā)揮抗血管生成的作用。結(jié)合以往文獻(xiàn)資料，我們?cè)O(shè)想ITAC的N端和N-LOOP區(qū)與IP10的C端融合，構(gòu)建一個(gè)新型融合分子，具有ITAC和IP10分子的各自?xún)?yōu)點(diǎn)，有望產(chǎn)生更顯著的抗腫瘤治療效果。我們首先對(duì)雙功能分子進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬。將ITAC的N端和N-LOOP區(qū)與IP10的C端氨基酸序列輸入InsightⅡ工作站，模擬結(jié)果表明，兩個(gè)

13、功能結(jié)構(gòu)域組合后能形成趨化因子樣穩(wěn)定的空間構(gòu)象，與IP10的氨基酸同源性達(dá)到66％，與已有的IP10的晶體衍射結(jié)構(gòu)相似，RMS值為1．08。通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增得到雙功能分子ITIP的全長(zhǎng)編碼基因，構(gòu)建pcDNA3-ITIP質(zhì)粒，電穿孔法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株4T1-ITIP。RT-PCR結(jié)果表明僅在4T1-ITIP細(xì)胞中有ITIP的轉(zhuǎn)錄。趨化實(shí)驗(yàn)表明，4T1-ITIP細(xì)胞上清對(duì)淋巴細(xì)胞具有顯著趨化活性，并能被CXCR

14、3抗體特異性阻斷，并且ITIP趨化活性與ITAC沒(méi)有差異，但是較IP10增強(qiáng)。這些結(jié)果提示4T1-ITIP細(xì)胞能分泌具有活性的ITIP蛋白。 4．雙功能分子的抗腫瘤作用及其機(jī)制 以4T1乳腺癌為模型研究了ITIP的抗腫瘤作用。將1×105 4T1-ITIP細(xì)胞皮下接種裸鼠，結(jié)果4T1—ITIP腫瘤與4T1—IP10腫瘤生長(zhǎng)較其余各組顯著減慢，提示T細(xì)胞可能也參與了ITIP介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制。 分析了ITIP在腫瘤

15、局部表達(dá)對(duì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。FACS分析腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示，CXCR3+淋巴細(xì)胞在4T1—ITIP腫瘤內(nèi)顯著增加，并且CXCR3+CD4+和CXCR3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例均高于對(duì)照組。我們進(jìn)一步檢測(cè)了ITIP對(duì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的效應(yīng)功能的影響。在荷瘤小鼠體內(nèi)被動(dòng)轉(zhuǎn)移CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞后，在4T1—ITIP腫瘤內(nèi)CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增。將腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在體外特異性刺激，4T1—ITIP腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞特異

16、性增殖應(yīng)答能力及殺傷活性顯著增強(qiáng)，IFN—γ分泌明顯增加。還分析了4T1—ITIP荷瘤小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。4T1—ITIP荷瘤小鼠脾細(xì)胞在體外以4T1特異性刺激后，脾細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)顯著增強(qiáng)，對(duì)4T1靶細(xì)胞的殺傷活性明顯增高。ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平，結(jié)果表明，4T1—ITIP組小鼠脾細(xì)胞IFN—γ和TNF—α分泌顯著增加而IL—4分泌水平顯著降低。提示ITIP表達(dá)能增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，并向Th1型免疫應(yīng)答偏移。

17、 為觀察ITIP對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，收集了4T1—ITIP細(xì)胞的培養(yǎng)上清，檢測(cè)4T1—ITIP細(xì)胞的培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)變化。結(jié)果顯示，在4T1—ITIP腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)顯著受到抑制，提示4T1—ITIP能分泌具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性的ITIP，發(fā)揮抗血管生成效應(yīng)。 綜上所述，抑制腫瘤血管生成并誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，是IP10及ITAC抗腫瘤的重要機(jī)制。增強(qiáng)IP10分子與其受體C