IP10，ITAC及其雙功能分子誘導的抗腫瘤免疫及機制研究.pdf

1、本研究以小鼠4T1乳腺癌為模型，觀察改變IP10或ITAC的表達對4T1腫瘤生長的影響及其機制。最后，根據(jù)趨化因子功能特點，將趨化因子作用顯著的結構域組合起來，構建了功能更顯著的抗腫瘤分子，可能為趨化因子用于腫瘤的生物學防治提供理論基礎和實驗依據(jù)。 1．IP10的抗腫瘤作用及其機制 構建了pcDNA3—IP10真核表達質粒。電穿孔的方法將質粒導入4T1細胞，獲得穩(wěn)定轉染細胞株4T1—IP10。雌性BALB/c小鼠及裸鼠皮

2、下接種4T1—IP10細胞后形成的腫瘤較對照組生長緩慢，腫瘤較小，重量較輕，并且4T1—IP10荷瘤小鼠存活時間明顯延長。實時定量PCR結果表明，在4T1—IP10腫瘤組織中IP10表達水平顯著上調。觀察了IP10對淋巴細胞在腫瘤局部浸潤的影響，結果表明，單位重量的4T1—IP10腫瘤浸潤淋巴細胞數(shù)量是對照組的兩倍；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞在4T1—IP10腫瘤內浸潤顯著增加；FACS分析腫瘤浸潤淋巴細胞的表型，結果顯示，4T1—I

3、P10腫瘤內CXCR3+CD4+T和CXCR3+CD8+T細胞比例均較對照組增高。將4T1—IP10腫瘤浸潤淋巴細胞分離出來，體外經特異性刺激后，增殖應答能力和特異性殺傷活性增強，腫瘤浸潤淋巴細胞IFN—γ分泌明顯增加。以上結果提示，募集并增強腫瘤浸潤淋巴細胞的效應功能在IP10介導的腫瘤生長抑制中具有重要的作用。進一步觀察了腫瘤局部IP10表達對機體細胞免疫應答的影響。體外特異性刺激后，4T1—IP10荷瘤小鼠的脾細胞抗原特異性增殖應

4、答能力及殺傷活性均較對照組顯著增高。腫瘤轉移是腫瘤患者常見的死亡原因，誘導有效的細胞免疫應答是抑制腫瘤轉移的策略之一。實驗性肺轉移研究發(fā)現(xiàn)，與對照比較，接種4T1—IP10的小鼠，經尾靜脈注射4T1細胞后，大體標本觀察發(fā)現(xiàn)，肺表面形成的轉移結節(jié)顯著減少。4T1—IP10組小鼠肺重明顯減輕，肺組織內轉移的細胞形成的克隆顯著減少。肺組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，4T1—IP10組肺組織內僅有小的單一轉移病灶，而對照組轉移灶較大并且可以形成多發(fā)的轉移病

5、灶。 以往研究表明IP10具有抗血管生成的作用，觀察了IP10抗血管效應在IP10介導的4T1腫瘤生長抑制中的作用。實驗結果表明，隨IP10濃度的增加，內皮細胞增殖顯著受到抑制。劃痕實驗表明，IP10能抑制bFGF誘導的血管內皮細胞遷移的80％。研究表明，IP10能顯著抑制bFGF誘導的血管生成。將血管內皮細胞在4T1—IP10腫瘤細胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，結果顯示，4T1—IP10腫瘤細胞的條件培養(yǎng)基能顯著延長血管內皮細胞的

6、生長周期，抑制血管內皮細胞增殖。腫瘤組織H&E染色，光學顯微鏡下觀察，在4T1—IP10腫瘤局部可以看到血管閉塞現(xiàn)象及腫瘤局灶性壞死，而對照組血管密度高，并可以看到大的血管腔，提示IP10能通過抑制血管內皮細胞生長，抗腫瘤血管生成，使腫瘤局部缺血壞死，發(fā)揮抗腫瘤作用。 2．ITAC的抗腫瘤作用及其機制 通過基因轉染的方法建立了穩(wěn)定轉染pcDNA3—ITAC的4T1細胞。將4T1—ITAC細胞在小鼠皮下接種，觀察腫瘤生長狀

7、況。結果顯示，在BALB/c小鼠及裸鼠體內4T1—ITAC腫瘤生長較對照組緩慢，腫瘤較小并且重量較輕，荷瘤小鼠存活時間明顯延長。但是在裸鼠體內4T1—ITAC生長抑制作用沒有在BALB/c小鼠體內明顯。提示T細胞可能參與了ITAC介導的腫瘤生長抑制。實時定量PCR結果表明，在4T1—ITAC腫瘤組織中ITAC表達水平顯著上調。為分析ITAC在腫瘤局部表達對腫瘤淋巴細胞浸潤的影響，分離并計數(shù)了腫瘤浸潤淋巴細胞，結果顯示，單位重量的4T1—

8、ITAC腫瘤內分離的淋巴細胞數(shù)量顯著增加，是對照組的3倍。鑒于ITAC是CXCR3的配體，分析了CXCR3+淋巴細胞在腫瘤內的浸潤情況。FACS分析表明，CXCR3+淋巴細胞比例在4T1—ITAC腫瘤顯著增高，并且在4T1—ITAC腫瘤內CXCR3+CD4+T和CXCR3+CD8+T淋巴細胞比例均高于對照組。分析了在腫瘤局部表達的ITAC對腫瘤浸潤淋巴細胞的效應功能的影響。結果發(fā)現(xiàn)4T1—ITAC腫瘤浸潤淋巴細胞，體外經4T1特異性刺激

9、后顯著增殖，殺傷活性較對照組明顯增強。ELISPOT檢測發(fā)現(xiàn)，4T1—ITAC腫瘤浸潤淋巴細胞IFN—γ分泌增加。這些結果表明ITAC能促進腫瘤淋巴細胞浸潤，并增強腫瘤浸潤淋巴細胞的效應功能，可能是ITAC介導腫瘤生長抑制的機制之一。為進一步確證ITAC的抗腫瘤效應，檢測了荷瘤小鼠的細胞免疫應答水平。結果顯示，4T1—ITAC荷瘤小鼠的脾細胞特異性增殖反應明顯增強，對4T1細胞的特異性殺傷活性增高。利用實驗性肺轉移模型檢測了4T1-IT

10、AC荷瘤小鼠對4T1細胞在體內播散轉移的影響。結果表明，接種4T1-ITAC腫瘤細胞的小鼠，其肺表面沒有明顯的轉移結節(jié)形成，肺重明顯減輕。肺組織轉移細胞克隆形成顯著減少。肺組織H&E染色觀察發(fā)現(xiàn)，4T1-ITAC組未見明顯的轉移病灶形成。這些結果提示ITAC在腫瘤局部表達能保護小鼠，降低腫瘤播散轉移的發(fā)生率。 檢測了ITAC的抗血管生成作用。劃痕實驗表明ITAC能抑制bFGF誘導的血管內皮細胞遷移的55％。MTT法檢測，隨ITA

11、C濃度的增加，對血管內皮細胞增殖的抑制效果不明顯。與4T1細胞培養(yǎng)上清比較，4T1-ITAC細胞的條件培養(yǎng)基能抑制血管內皮細胞增殖，但是與RPMI1640組比較沒有顯著差異。以上結果可能提示，ITAC具有一定的抗血管作用，并且參與了ITAC介導的腫瘤生長抑制，但不是主要的機制。 3．雙功能分子的設計及構建 將先前的結果進行了統(tǒng)計學分析。與IP10比較，ITAC具有較強的趨化作用及誘導抗腫瘤細胞免疫應答的作用。結構功能分析

12、表明，趨化因子的N端和N-LOOP區(qū)是結合及活化受體的關鍵部位，而趨化因子的C端可以結合在血管內皮細胞表面，發(fā)揮抗血管生成的作用。結合以往文獻資料，我們設想ITAC的N端和N-LOOP區(qū)與IP10的C端融合，構建一個新型融合分子，具有ITAC和IP10分子的各自優(yōu)點，有望產生更顯著的抗腫瘤治療效果。我們首先對雙功能分子進行計算機模擬。將ITAC的N端和N-LOOP區(qū)與IP10的C端氨基酸序列輸入InsightⅡ工作站，模擬結果表明，兩個

13、功能結構域組合后能形成趨化因子樣穩(wěn)定的空間構象，與IP10的氨基酸同源性達到66％，與已有的IP10的晶體衍射結構相似，RMS值為1．08。通過PCR的方法擴增得到雙功能分子ITIP的全長編碼基因，構建pcDNA3-ITIP質粒，電穿孔法將質粒轉染4T1細胞并篩選穩(wěn)定轉染細胞株4T1-ITIP。RT-PCR結果表明僅在4T1-ITIP細胞中有ITIP的轉錄。趨化實驗表明，4T1-ITIP細胞上清對淋巴細胞具有顯著趨化活性，并能被CXCR

14、3抗體特異性阻斷，并且ITIP趨化活性與ITAC沒有差異，但是較IP10增強。這些結果提示4T1-ITIP細胞能分泌具有活性的ITIP蛋白。 4．雙功能分子的抗腫瘤作用及其機制 以4T1乳腺癌為模型研究了ITIP的抗腫瘤作用。將1×105 4T1-ITIP細胞皮下接種裸鼠，結果4T1—ITIP腫瘤與4T1—IP10腫瘤生長較其余各組顯著減慢，提示T細胞可能也參與了ITIP介導的腫瘤生長抑制。 分析了ITIP在腫瘤

15、局部表達對淋巴細胞浸潤的影響。FACS分析腫瘤浸潤淋巴細胞，結果顯示，CXCR3+淋巴細胞在4T1—ITIP腫瘤內顯著增加，并且CXCR3+CD4+和CXCR3+CD8+T淋巴細胞比例均高于對照組。我們進一步檢測了ITIP對腫瘤浸潤淋巴細胞的效應功能的影響。在荷瘤小鼠體內被動轉移CFSE標記的淋巴細胞后，在4T1—ITIP腫瘤內CFSE標記的淋巴細胞出現(xiàn)明顯的擴增。將腫瘤浸潤淋巴細胞在體外特異性刺激，4T1—ITIP腫瘤浸潤淋巴細胞特異

16、性增殖應答能力及殺傷活性顯著增強，IFN—γ分泌明顯增加。還分析了4T1—ITIP荷瘤小鼠細胞免疫應答水平。4T1—ITIP荷瘤小鼠脾細胞在體外以4T1特異性刺激后，脾細胞特異性增殖反應顯著增強，對4T1靶細胞的殺傷活性明顯增高。ELISA檢測細胞因子分泌水平，結果表明，4T1—ITIP組小鼠脾細胞IFN—γ和TNF—α分泌顯著增加而IL—4分泌水平顯著降低。提示ITIP表達能增強機體細胞免疫應答水平，并向Th1型免疫應答偏移。

17、 為觀察ITIP對血管內皮細胞生長的影響，收集了4T1—ITIP細胞的培養(yǎng)上清，檢測4T1—ITIP細胞的培養(yǎng)基中血管內皮細胞生長動力學變化。結果顯示，在4T1—ITIP腫瘤細胞的條件培養(yǎng)基中，血管內皮細胞的生長顯著受到抑制，提示4T1—ITIP能分泌具有抑制血管內皮細胞生長活性的ITIP，發(fā)揮抗血管生成效應。 綜上所述，抑制腫瘤血管生成并誘導有效的抗腫瘤免疫應答，是IP10及ITAC抗腫瘤的重要機制。增強IP10分子與其受體C