牛卵泡卵母細胞體外成熟與核移植電融合參數的優(yōu)化.pdf

1、本試驗在體外成熟培養(yǎng)液中添加EGF和IGF-Ⅰ，研究其對牛卵母細胞核及胞質成熟的作用，并通過孤雌激活來檢測EGF和IGF-Ⅰ對牛卵母細胞胞質成熟的影響；同時以牛乳腺上皮細胞為核供體，以牛MⅡ期卵母細胞為核受體，以電融合法構建重構胚，通過比較不同的電場強度、脈沖時長、供體細胞的不同處理方式以及不同的融合液組成等，系統(tǒng)的研究了不同因素對重構胚融合效率的影響，旨在優(yōu)化融合程序，提高重構胚的電融合率和重構胚的發(fā)育率。試驗結果如下： 1.

2、在成熟培養(yǎng)液中分別添加0，10，50，100ng/mL的表皮生長因子(EGF)，24h檢查成熟率，在含5μmol/L離子霉素的CR1aa培養(yǎng)液中處理5min，然后在含2mmol/L6-DMAP的CR1aa培養(yǎng)液中培養(yǎng)4h，用CR1aa培養(yǎng)液洗三次后進行分組培養(yǎng)，48h檢查卵裂率，7～8天檢查囊胚發(fā)育率。結果表明，添加EGF能夠提高卵母細胞的體外成熟，促進孤雌激活胚卵裂率和囊胚發(fā)育率，以添加50ng/mL時的成熟率、卵裂率和囊胚發(fā)育率最高

3、，分別為78.28％、86.50％、24.81％同對照組(65.05％、73.68％、10.20％)相比差異顯著(P＜0.05)，表明添加50ng/mL的EGF，無論是對卵母細胞成熟的促進，還是對孤雌胚卵裂率和囊胚發(fā)育率都可以得到理想的效果。 2.在成熟培養(yǎng)液中分別加入0，10，50，100ng/mL的胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)，觀察成熟率、孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率。添加IGF-Ⅰ能夠促進卵母細胞的體外成熟，提高孤雌胚

4、的卵裂率和囊胚發(fā)育率，以添加100ng/mL時的成熟率、卵裂率和囊胚發(fā)育率最高，分別為76.67％、83.85％、20.74％同對照組(65.05％、73.68％、10.20％)相比差異顯著(P＜0.05)。結果表明添加100ng/mL的IGF-Ⅰ能夠促進牛卵母細胞的體外成熟，同時也能夠提高孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率。 3.在體外成熟過程中分別加入50ng/mLEGF，100ng/mLIGF-Ⅰ或者50ng/mLEGF/100n

5、g/mLIGF-Ⅰ，觀察成熟率、孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率。EGF/IGF-Ⅰ能夠促進卵裂率和囊胚發(fā)育率，分別為86.15％、87.05％、28.21％，同對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，同單獨添加EGF和IGF-Ⅰ組相比差異不顯著(P＞0.05)，表明EGF/IGF-Ⅰ能夠促進牛卵母細胞的體外成熟，提高孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率。 4.用不同電場強度2.0、2.4、2.8kv/cm，其他參數為20μs，2次脈沖，10ms

6、不變的情況下，觀察電場強度對重構胚融合率及早期發(fā)育的影響。結果表明，不同電場強度對融合率的影響顯著(P＜0.05)，以2.4kv/cm融合效率(55.77％)最好。 5.用不同脈沖時長10μs、20μs、30μs，其它參數2.4kv/cm，2次脈沖，10ms不變的情況下，觀察其對重構胚融合率及早期發(fā)育的影響。結果表明，不同脈沖時長對融合率的影響顯著(P＜0.05)，以20μs融合效率最好。 6.在液氮(-196℃)冷凍保

7、存細胞解凍后直接用做核供體細胞以及未經冷凍保存過的新鮮細胞直接用于核供體，觀察對融合率的影響及重構胚早期發(fā)育的影響，核供體細胞經冷凍保存解凍后直接用于核移植，同新鮮對照細胞相比，對電融合率及早期發(fā)育沒有顯著影響(P＞0.05)。 7.分別用D-山梨醇和D-甘露醇電融合液，研究其對電融合及核移植胚早期發(fā)育的影響，其融合率分別為59.22、56.36％，不同電融合液組成對電融合率影響差異不顯著(P＞0.05)，但山梨醇融合液融合率略