靶向端粒g-四鏈體DNA的抗腫瘤鉑化合物的合成、表征及其作用機理研究.pdf

1、DNA是一個經(jīng)典的抗腫瘤藥物靶點。然而，在細胞核內(nèi)中存在著大量的雙螺旋DNA，以雙螺旋DNA為靶點的抗腫瘤藥物會非特異性的結(jié)合到DNA上，產(chǎn)生嚴重的毒副作用。為了降低抗腫瘤藥物的毒副作用，設計合成毒性低、選擇性更好的抗腫瘤藥物是當今藥物學家面臨的巨大挑戰(zhàn)。除了雙螺旋結(jié)構(gòu)外，核酸的一些二級結(jié)構(gòu)，如富G序列形成的G-四鏈體DNA也成為重要的抗腫瘤藥物靶點。與雙螺旋結(jié)構(gòu)相比，G-四鏈體DNA在尺寸、loop和結(jié)構(gòu)上有很大的不同，而G-四鏈體結(jié)

2、構(gòu)的這種多樣性，則使設計合成能夠選擇性識別G-四鏈體DNA的小分子配體成為可能。
　　本文主要目標是合成以G-四鏈體DNA為靶點的活性好、毒性低的抗腫瘤配合物。為此，設計合成了一系列取代基不一樣的多吡啶鉑配合物21個，并對其進行了結(jié)構(gòu)表征。用譜學方法研究了這些配合物對ct-DNA和G-四鏈體DNA的選擇性，并且通過體外生物實驗檢測了這些配合物對端粒酶活性的抑制作用和對腫瘤細胞增殖的影響，以及它們對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERTmRNA表

3、達的影響。初步探討了其抗腫瘤作用機理。
　　本文分為四章:
　　第一章，為前言，簡述了G-四鏈體DNA的結(jié)構(gòu)特征及其生物學功能;端粒DNA的結(jié)構(gòu)和功能;以G-四鏈體為靶點的抗腫瘤小分子配體的研究進展。
　　第二章，本論文合成了21個1，10-菲羅啉苯并咪唑衍生物的鉑(Ⅱ)配合物，并用ESI-MS、元素分析、IR、1HNMR和UV-Vis等對其結(jié)構(gòu)進行了表征。
　　第三章，MTT實驗結(jié)果表明，大部分配合物對腫瘤細胞

4、株(MGC80-3、BEL-7404、SPC-A-2和HeLa)的生長均表現(xiàn)出很強的抑制作用，絕大部分配合物的IC50在20μmol/L以下，配合物對SPC-A-2活性的抑制作用尤其明顯，而且配合物對人正常肝細胞株(HL-7702)毒性較低?？偨Y(jié)構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)，取代基對配合物的抗腫瘤活性有比較大的影響，甲氧基取代基配合物有很強的抗腫瘤活性，羥基取代基配合物的活性次之，硝基取代基的活性最差。
　　流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，配合物1-9作用于

5、人宮頸癌細胞HeLa72 h后，將宮頸癌細胞HeLa阻滯于sub-G1期，亞二倍體sub-G1的出現(xiàn)，表明配合物1-9能夠誘導宮頸癌細胞HeLa凋亡，宮頸癌細胞HeLa的細胞周期sub-G1期DNA含量的增加呈濃度依賴性。配合物1-9誘導宮頸癌細胞HeLa凋亡呈濃度依賴性。
　　端粒酶活性的抑制作用和hTERT mRNA的表達調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，篩選的9種配合物對端粒酶都有很強抑制作用，端粒酶活性抑制率在62.16％到85.39％，配合

6、物1-9都能夠下調(diào)HeLa細胞中hTERT mRNA的表達。
　　第四章，用紫外、熒光和圓二色等譜學方法研究了21個配合物與不同DNA(ct-DNA和G-quadruplex DNA)的相互作用，結(jié)果如下:
　　1.配合物能夠與DNA產(chǎn)生靜電相互作用。所有配合物與SDS作用后，隨著SDS濃度從[SDS]∶[配合物]=0-2.5逐漸增大，配合物的最大紫外吸收都出現(xiàn)了減色效應，減色率在35-59％之間，減色是因為配合物與SDS的

7、磺酸基相互作用引起的。
　　2.用紫外光譜研究了配合物與ct-DNA和G-四鏈體DNA的相互作用。配合物與DNA的作用引起配合物吸收峰減色，部分配合物的最大吸收發(fā)生紅移，這是配合物與ct-DNA之間存在靜電作用和經(jīng)典插入作用共同引起的。而配合物與端粒G-四鏈體H21T除采取堆積模式結(jié)合外，還可能與G-四鏈體DNA的磷酸骨架和loop作用。配合物與G-四鏈體H21T作用的結(jié)合常數(shù)（Kb）約為ct-DNA結(jié)合常數(shù)的25～95倍，配合物

8、會優(yōu)先與端粒G-四鏈體H21T結(jié)合。吸電子基團的存在有助于增強配合物與ct-DNA的相互作用，而供電子基團的存在有助于增強配合物與G-四鏈體的堆積作用。
　　3.用熒光競爭法(G4-FID)實驗研究配合物對四種G-四鏈體DNA(ckit1、ckit2、H21T、pu22)和一種雙螺旋DNA(ds26)的選擇性。配合物與不同G-四鏈體DNA有很強的結(jié)合作用，DC50值在0.2-0.9μmol/L之間，與雙螺旋DNA(ds26)作用的

9、DC50值在1.2-2.0μmol/L之間。配合物與G-四鏈體DNA結(jié)合能力強于雙螺旋DNA，配合物對端粒G-四鏈體H21T具有一定的選擇性識別作用，但這種選擇性不是很明顯。FRET熔點實驗發(fā)現(xiàn)所篩選的8個配合物能提高G-四鏈體F21T的解鏈溫度Tm值，說明配合物能有效的穩(wěn)定端粒G-四鏈體H21T。
　　4.用CD光譜研究了不同DNA和配合物作用后DNA的構(gòu)象變化。當配合物加入到ct-DNA中時，ct-DNA的正負吸收峰都發(fā)生了明

10、顯的強度改變，部分配合物還發(fā)生了藍移;而配合物能使溶液中無序的單鏈端粒DNA在290nm處弱吸收峰強度增加，在263 nm附近新的負吸收峰強度也增強，誘導單鏈端粒DNA形成反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)。配合物加入到混合型端粒G-四鏈體DNA中，使平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)的特征吸收峰消失，反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)的特征吸收峰增強?？梢娕浜衔锬軌蛘T導單鏈的端粒DNA形成反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并穩(wěn)定這種結(jié)構(gòu)。結(jié)合MTT法、CD、UV-Vis和G4-FID的實驗