肝癌多基因表達異常初步研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC，簡稱肝癌)是常見的惡性腫瘤之一，目前對其治療手段有限，預(yù)后較差。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個多病因、多階段、多因素參與的過程。在肝細胞癌變過程中存在眾多基因表達異常，如抑癌基因的突變或缺失，癌基因的激活、DNA修復(fù)基因的異常表達等。眾多基因在肝癌中的表達情況及在肝癌中的作用還不清楚。慢性乙型肝炎病毒(HepatitisBVires，HBV)感染與肝硬化、肝癌的發(fā)生進展密切相

2、關(guān)，研究表明HBV感染及其相關(guān)性肝硬化是肝癌發(fā)生的危險因素。我國是HBV流行的高發(fā)區(qū)，研究認為HBV整合到宿主細胞基因組中改變了細胞基因表達是感染HBV肝細胞癌變的關(guān)鍵。因此有必要研究HBV相關(guān)性肝硬化和肝癌的基因表達譜，這對乙肝相關(guān)性肝癌的診斷、治療、預(yù)防具有重要意義?；蛐酒菍⒋罅堪谢?或基因片段)有序地、高密度地點在玻璃片或塑料片上等載體所形成的矩陣，分為在固相載體上進行原位合成或事先合成寡核苷酸探針或cDNA后固定于載體表面

3、兩種芯片，寡核苷酸芯片屬于前者。與傳統(tǒng)生物學方法比較，芯片檢測具有高通量、高效及較高的特異性和敏感性的特點，可以利用芯片進行肝癌功能基因組學研究，為肝癌診斷提供工具并有助于發(fā)展新的治療手段。因此本實驗利用寡核苷酸芯片研究HBV相關(guān)性肝癌基因表達譜，篩選肝癌差異基因并初步分析部分基因在肝癌中的作用，為肝癌的預(yù)防、診斷和治療提供分子生物學資料；并利用生物信息學方法分析癌基因、抑癌基因、DNA修復(fù)基因和細胞周期相關(guān)基因在肝癌中的具體表達情況和

4、作用。 材料與方法 15例肝癌組織來自河南省人民醫(yī)院住院手術(shù)患者，5例肝硬化及5例正常肝組織來自同期因其它肝臟疾病住院手術(shù)患者，所有標本在離體后0．5小時內(nèi)放入液氮中冷凍保存。肝癌及肝硬化患者HBV表面抗原均陽性，均無放射治療或化療史。所有標本均行普通HE染色，光鏡下確定標本組織類型。用TRIzol試劑抽提組織RNA后并純化，凝膠電泳檢驗RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，合成生物素標記的cRNA后和含有18993個已知基因

5、的AffymetrixU133plus2．0芯片進行雜交。用GenePix4000A熒光激光掃描系統(tǒng)對芯片進行掃描，GenePixPro3．0分析軟件處理雜交信號，microarraysuite5．0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算Ratio值(Cy5／Cy3)，獲取結(jié)果。表達變化2倍以上的基因即其Cy5／Cy3大于2或小于0．5的基因被認為是差異表達基因。表達變化5倍以上的基因即其Cy5／Cy3大于5或小于0．2的基因被認為是明顯差異表達基因。

6、Northern印跡技術(shù)檢驗芯片分析結(jié)果的可靠性。查閱NCBI、GENEMAP、KEGG、BIOCARTA等網(wǎng)站和AffymetrixU133plus2．0信息資料獲得人類癌基因406個，317個基因可以在芯片中查找到；抑癌基因29個，在芯片上均可找到；DNA修復(fù)基因246個，有239個在芯片上可以找到；細胞周期相關(guān)基因81個，有80個在芯片上可以找到。 結(jié)果 1.總RNAD260／D280>1．9，18s和28s電泳條

7、帶清晰芯片，RNA質(zhì)量可靠；Northern印跡的分析結(jié)果和寡核苷酸芯片結(jié)果具有可重復(fù)性。 2.與正常肝組織相比，篩選肝硬化差異表達基因118個，其中上調(diào)表達基因數(shù)為63,下調(diào)表達基因數(shù)為55；明顯差異表達基因13個，上調(diào)基因8個，下調(diào)基因5個。 3.與正常肝組織相比，篩選肝癌差異表達基因1455個，其中上調(diào)表達基因761個，下調(diào)表達基因數(shù)694個；明顯差異表達基因241個，上調(diào)基因169個，下調(diào)基因72個。 4

8、.對比研究肝硬化和肝癌共同差異基因表達表明，在肝硬化上調(diào)表達的基因中，25個基因繼續(xù)在肝癌中上調(diào)表達，2個基因下調(diào)表達，36個基因在肝癌中陰性表達；在肝硬化下調(diào)表達的基因中，36個基因繼續(xù)在肝癌中下調(diào)表達，1個上調(diào)表達，18個在肝癌中陰性表達。 5.在基因芯片317個原癌基因中，表達陽性基因51個，其中17個下調(diào)表達，34個上調(diào)表達。29個抑癌基因中，陽性表達基因5個，其中3個下調(diào)表達，2個上調(diào)表達。239個DNA修復(fù)基因中，陽

9、性表達基因47個，其中14個下調(diào)表達，33個上調(diào)表達。80個細胞周期相關(guān)基因中，陽性表達基因18個，其中4個下調(diào)表達，14個上調(diào)表達。 結(jié)論 1.利用寡核苷酸表達譜芯片分析肝癌基因表達變化，能夠快速篩查出新的肝癌相關(guān)基因及其在肝癌中表達情況。 2.有1455個基因在HBV相關(guān)性肝癌中發(fā)生表達異常，其中761個基因上調(diào)表達，694個基因下調(diào)表達。癌基因、生長因子類、轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等基因上調(diào)表達；肝特異基因、免疫

10、相關(guān)基因、代謝酶類等基因下調(diào)表達。 3.有118個基因在HBV相關(guān)性肝硬化中表達異常，其中上調(diào)表達基因63個，下調(diào)表達基因55個。 4.在肝硬化和肝癌中其共同表達陽性基因占肝硬化陽性基因的54．2％，表明這部分差異表達基因在肝癌的發(fā)生中起重要作用，肝硬化和肝癌的發(fā)生具有共同的分子生物學基礎(chǔ)。在肝硬化和肝癌中共同差異表達基因占肝癌差異表達基因的4．4％，表明肝癌是在肝硬化基礎(chǔ)之上發(fā)生更多基因表達異常的結(jié)果。 5.肝