肝癌多基因表達(dá)異常初步研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC，簡(jiǎn)稱肝癌)是常見的惡性腫瘤之一，目前對(duì)其治療手段有限，預(yù)后較差。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多病因、多階段、多因素參與的過程。在肝細(xì)胞癌變過程中存在眾多基因表達(dá)異常，如抑癌基因的突變或缺失，癌基因的激活、DNA修復(fù)基因的異常表達(dá)等。眾多基因在肝癌中的表達(dá)情況及在肝癌中的作用還不清楚。慢性乙型肝炎病毒(HepatitisBVires，HBV)感染與肝硬化、肝癌的發(fā)生進(jìn)展密切相

2、關(guān)，研究表明HBV感染及其相關(guān)性肝硬化是肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。我國(guó)是HBV流行的高發(fā)區(qū)，研究認(rèn)為HBV整合到宿主細(xì)胞基因組中改變了細(xì)胞基因表達(dá)是感染HBV肝細(xì)胞癌變的關(guān)鍵。因此有必要研究HBV相關(guān)性肝硬化和肝癌的基因表達(dá)譜，這對(duì)乙肝相關(guān)性肝癌的診斷、治療、預(yù)防具有重要意義?；蛐酒菍⒋罅堪谢?或基因片段)有序地、高密度地點(diǎn)在玻璃片或塑料片上等載體所形成的矩陣，分為在固相載體上進(jìn)行原位合成或事先合成寡核苷酸探針或cDNA后固定于載體表面

3、兩種芯片，寡核苷酸芯片屬于前者。與傳統(tǒng)生物學(xué)方法比較，芯片檢測(cè)具有高通量、高效及較高的特異性和敏感性的特點(diǎn)，可以利用芯片進(jìn)行肝癌功能基因組學(xué)研究，為肝癌診斷提供工具并有助于發(fā)展新的治療手段。因此本實(shí)驗(yàn)利用寡核苷酸芯片研究HBV相關(guān)性肝癌基因表達(dá)譜，篩選肝癌差異基因并初步分析部分基因在肝癌中的作用，為肝癌的預(yù)防、診斷和治療提供分子生物學(xué)資料；并利用生物信息學(xué)方法分析癌基因、抑癌基因、DNA修復(fù)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因在肝癌中的具體表達(dá)情況和

4、作用。 材料與方法 15例肝癌組織來自河南省人民醫(yī)院住院手術(shù)患者，5例肝硬化及5例正常肝組織來自同期因其它肝臟疾病住院手術(shù)患者，所有標(biāo)本在離體后0．5小時(shí)內(nèi)放入液氮中冷凍保存。肝癌及肝硬化患者HBV表面抗原均陽性，均無放射治療或化療史。所有標(biāo)本均行普通HE染色，光鏡下確定標(biāo)本組織類型。用TRIzol試劑抽提組織RNA后并純化，凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，合成生物素標(biāo)記的cRNA后和含有18993個(gè)已知基因

5、的AffymetrixU133plus2．0芯片進(jìn)行雜交。用GenePix4000A熒光激光掃描系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，GenePixPro3．0分析軟件處理雜交信號(hào)，microarraysuite5．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算Ratio值(Cy5／Cy3)，獲取結(jié)果。表達(dá)變化2倍以上的基因即其Cy5／Cy3大于2或小于0．5的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因。表達(dá)變化5倍以上的基因即其Cy5／Cy3大于5或小于0．2的基因被認(rèn)為是明顯差異表達(dá)基因。

6、Northern印跡技術(shù)檢驗(yàn)芯片分析結(jié)果的可靠性。查閱NCBI、GENEMAP、KEGG、BIOCARTA等網(wǎng)站和AffymetrixU133plus2．0信息資料獲得人類癌基因406個(gè)，317個(gè)基因可以在芯片中查找到；抑癌基因29個(gè)，在芯片上均可找到；DNA修復(fù)基因246個(gè)，有239個(gè)在芯片上可以找到；細(xì)胞周期相關(guān)基因81個(gè)，有80個(gè)在芯片上可以找到。 結(jié)果 1.總RNAD260／D280>1．9，18s和28s電泳條

7、帶清晰芯片，RNA質(zhì)量可靠；Northern印跡的分析結(jié)果和寡核苷酸芯片結(jié)果具有可重復(fù)性。 2.與正常肝組織相比，篩選肝硬化差異表達(dá)基因118個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)為63,下調(diào)表達(dá)基因數(shù)為55；明顯差異表達(dá)基因13個(gè)，上調(diào)基因8個(gè)，下調(diào)基因5個(gè)。 3.與正常肝組織相比，篩選肝癌差異表達(dá)基因1455個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因761個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因數(shù)694個(gè)；明顯差異表達(dá)基因241個(gè)，上調(diào)基因169個(gè)，下調(diào)基因72個(gè)。 4

8、.對(duì)比研究肝硬化和肝癌共同差異基因表達(dá)表明，在肝硬化上調(diào)表達(dá)的基因中，25個(gè)基因繼續(xù)在肝癌中上調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，36個(gè)基因在肝癌中陰性表達(dá)；在肝硬化下調(diào)表達(dá)的基因中，36個(gè)基因繼續(xù)在肝癌中下調(diào)表達(dá)，1個(gè)上調(diào)表達(dá)，18個(gè)在肝癌中陰性表達(dá)。 5.在基因芯片317個(gè)原癌基因中，表達(dá)陽性基因51個(gè)，其中17個(gè)下調(diào)表達(dá)，34個(gè)上調(diào)表達(dá)。29個(gè)抑癌基因中，陽性表達(dá)基因5個(gè)，其中3個(gè)下調(diào)表達(dá)，2個(gè)上調(diào)表達(dá)。239個(gè)DNA修復(fù)基因中，陽

9、性表達(dá)基因47個(gè)，其中14個(gè)下調(diào)表達(dá)，33個(gè)上調(diào)表達(dá)。80個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因中，陽性表達(dá)基因18個(gè)，其中4個(gè)下調(diào)表達(dá)，14個(gè)上調(diào)表達(dá)。 結(jié)論 1.利用寡核苷酸表達(dá)譜芯片分析肝癌基因表達(dá)變化，能夠快速篩查出新的肝癌相關(guān)基因及其在肝癌中表達(dá)情況。 2.有1455個(gè)基因在HBV相關(guān)性肝癌中發(fā)生表達(dá)異常，其中761個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，694個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。癌基因、生長(zhǎng)因子類、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等基因上調(diào)表達(dá)；肝特異基因、免疫

10、相關(guān)基因、代謝酶類等基因下調(diào)表達(dá)。 3.有118個(gè)基因在HBV相關(guān)性肝硬化中表達(dá)異常，其中上調(diào)表達(dá)基因63個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因55個(gè)。 4.在肝硬化和肝癌中其共同表達(dá)陽性基因占肝硬化陽性基因的54．2％，表明這部分差異表達(dá)基因在肝癌的發(fā)生中起重要作用，肝硬化和肝癌的發(fā)生具有共同的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。在肝硬化和肝癌中共同差異表達(dá)基因占肝癌差異表達(dá)基因的4．4％，表明肝癌是在肝硬化基礎(chǔ)之上發(fā)生更多基因表達(dá)異常的結(jié)果。 5.肝