多基因表達分析用于肝癌分子診斷指數(shù)的初步研究.pdf

1、肝細胞癌（簡寫HCC）的發(fā)生和發(fā)展是多基因參與、多階段進行的復雜過程，基因表達分析能對肝癌的診斷與預后提供幫助。然而在單項測定這些腫瘤標志物時其靈敏性、特異性、或臨床實用性等方面或多或少都存在一定的局限性。隨著腫瘤基因組學研究的不斷深入，越來越多的肝癌相關基因被報道，因此，綜合分析肝癌發(fā)生過程中多基因的表達變化，有助于優(yōu)化更多的分子指標來聯(lián)合診斷HCC。 研究目的：從本實驗室建立的HCC高/低表達基因cDNA文庫和國內(nèi)外文獻中篩

2、選肝癌高表達基因10個（ANGPT2、BIRC5、CLDN10、E2F1、GPC3、HGF、MMP2、PIN1、SPINT2、TFDP1）和低表達基因6個（APC、DLC1、MGMT、P16、PRDM2、PTEN），合計16個基因。利用實時熒光定量RT-PCR技術研究其在正常肝、肝炎、肝硬化、肝癌組織和癌旁組織間的差異表達情況，及與臨床病理學特征的關系，最終篩選在HCC中表達水平較正常肝細胞差異大、特異性好的基因建立分子診斷指數(shù)（Mol

3、ecular Diagnostic Index，MDI），初步評估其在HCC診斷中的價值。 研究方法：選擇81例手術切除組織標本，其中5例正常肝、4例慢性肝炎、12例肝硬化、60例HCC和癌旁組織，提取總RNA后逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR對16個進行基因的表達分析，以管家基因G3PDH為作為參比基因，2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量，依據(jù)表達異常的基因個數(shù)建立分子診斷指數(shù)；用ROC曲線評價分子診斷指數(shù)對肝癌的診

4、斷價值；免疫組化法分析GPC3在組織中蛋白表達水平，ELISA檢測HGF在血清中的含量，進一步與實時熒光定量PCR結果進行比對分析。 研究結果：依據(jù)各基因的熒光定量相對值做散點圖，GPC3、E2F1、BIRC5等癌基因從肝炎、肝硬化到癌組織呈現(xiàn)明顯的遞增趨勢，而MGMT、DLC1和PRDM2等抑癌基因呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢；同時簇狀柱狀圖表明上述癌基因在部分患者中從癌旁組織2cm（N2）、0cm（NO）到癌組織的表達呈現(xiàn)明顯的遞增趨

5、勢，而抑癌基因呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢。通過對每個基因在正常肝、肝炎、肝硬化、肝癌組的相對定量值進行統(tǒng)計學分析，表明BIRC5（正常組1.15±0.45，肝炎組1.52±0.38，肝硬化組2.08±0.87，肝癌組10.72±0.68）、CLDN10（正常組1.07±0.41，肝炎組1.81±0.63，肝硬化組2.48±0.43，肝癌組0.86±1.21）、GPC3（正常組1.12±0.45，肝炎組1.33±0.84，肝硬化組9.76±2.3

6、3，肝癌組147.52±1.53）、TFDP1（正常組1.06±0.23，肝炎組0.92±0.38，肝硬化組1.41±1.23，肝癌組0.50±1.32）、DLC1（正常組1.15±0.66，肝炎組1.38±0.67，肝硬化組2.09±0.21，肝癌組0.66±0.56）、HGF（正常組1.04±0.32，肝炎組2.38±1.22，肝硬化組3.81±2.56，肝癌組0.94±0.54）、MGMT（正常組1.14±0.52，肝炎組0.94

7、±0.34，肝硬化組1.16±2.12，肝癌組0.39±1.12）、PRDM2（正常組1.13±0.61，肝炎組1.06±0.23，肝硬化組1.53±1.67，肝癌組0.55±0.65）等8個基因在兩組或多組間存在差異（P<0.05），具有統(tǒng)計學意義。在此基礎上選擇GPC3、E2F1、BIRC5、MGMT、DLC1和PRDM2等6個基因建立肝癌分子診斷指數(shù)MDI，結果顯示其在正常組和肝炎組為0，在肝硬化組為0.83±0.83，在N2值為

8、1.35±0.99，NO組為1.55±1.14，HCC為4.42±1.20，差異顯著；每個標本的MDI從癌旁到癌組織呈上升趨勢；ROC曲線分析顯示MDI≥3時診斷肝癌，其敏感性為96.65％，特異性92.85％，AUC為99.4％；將MDI為5、6的標本定義為高MDI組，MDI為3、4的標本定義為低MDI組，結果顯示后者生存曲線略高，低MDI組預后較好；MDI≥3的例數(shù)（58/60）與臨床資料中AFP值（21/60）對比分析表明MDI對

9、肝癌診斷敏感性高于AFP。進一步，免疫組化檢GPC3顯示60例癌標本中45例高表達，ELISA檢測血清中GPC3表達顯示肝癌組為（1.40±0.33）ng/ml高于正常對照組（0.40±0.04）ng/ml；HGF免疫組化結果顯示癌旁組織染色強于肝癌組織，同時血清表達水平肝癌組（1.34±0.16）ng/ml高于正常組（0.25±0.04）ng/ml。 研究結論：通過實時熒光定量RT-PCR分析16個基因在正常肝、肝炎、肝硬化、