基于毛細(xì)管整體柱的復(fù)雜體系微分離分析方法學(xué)研究.pdf

1、微分析技術(shù)是近年來興起的一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的新型儀器分析技術(shù)。此類技術(shù)充分運(yùn)用微小容器及管路(直徑500μm～10μm)，與現(xiàn)有檢測技術(shù)（如UV、MS、熒光等）相結(jié)合，通過空間的集約和聚焦，最大限度地提高反應(yīng)或檢測的效率，并將樣品、溶劑的消耗降至最低。至此，分析化學(xué)得以提升至納升水平。微分析技術(shù)自問世以來，相關(guān)領(lǐng)域研究人員不斷進(jìn)行創(chuàng)新和改進(jìn)，其應(yīng)用范圍已拓展到化工、生物樣品分析、蛋白組學(xué)研究、細(xì)胞生物學(xué)、藥物及代謝產(chǎn)物檢測等諸多領(lǐng)

2、域，并有大量專利、科研論文和技術(shù)成果。
　　 對于藥物分析領(lǐng)域而言，復(fù)雜體系包含天然產(chǎn)物和生物體液樣品。對于前者而言，包括中藥為主的植物藥、動(dòng)物藥和礦物藥，它們對于人類的文明與健康水平的提升一直起著至關(guān)重要的作用。因此從遠(yuǎn)古時(shí)代起，對于中藥及天然藥物的研究從未斷絕。然而，中藥配伍和成分復(fù)雜，基質(zhì)、雜質(zhì)和各活性成分之間的干擾及相互作用機(jī)理較為模糊;因此研究一種藥物的成分及其含量，對于其分析方法及儀器技術(shù)的要求則更為復(fù)雜和高深。而對

3、于生物體液樣品，如血漿和體液、組織液樣品，由于其樣品基質(zhì)中大量存在的蛋白、干擾離子和其他成分，這會(huì)影響藥物的提取，降低分析方法的靈敏度和選擇性;更何況，藥物在體內(nèi)也未必以游離態(tài)存在。因此對于體內(nèi)生物樣品的分離、純化和富集，而后進(jìn)行有針對性的檢測，這是擺在藥物分析工作者面前的難題。
　　 因此，分離分析復(fù)雜體系需要更為快速、靈敏、高效和專屬性較高的檢測技術(shù)和分析方法，也刺激了儀器分析和相關(guān)技術(shù)及方法學(xué)研究與應(yīng)用的進(jìn)步。時(shí)至今日，高

4、效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MS)和紫外分光光度法(UV)依舊是分析復(fù)雜體系樣品最為成熟可靠的手段。當(dāng)然，這些方法或多或少存在分離模式單一、效率提升空間有限、樣品和溶劑消耗量較大以及小型化受限等缺點(diǎn)。這雖然給分析工作者提出了更多更難的挑戰(zhàn)，但也為微分離分析技術(shù)的發(fā)展提供了廣闊的前景。
　　 在各種分析技術(shù)中，毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)是其中應(yīng)用較為廣泛，儀器設(shè)

5、備和分析方法較為成熟的一種。它是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)?；驹硎?，在外加電場作用下，緩沖液中的離子和毛細(xì)管內(nèi)壁的游離硅醇基形成雙電層結(jié)構(gòu)，進(jìn)而產(chǎn)生一個(gè)電勢，即Zeta電勢，產(chǎn)生電滲流（electroosmotic flow，EOF）帶動(dòng)管內(nèi)離子沿著電場方向遷移。由于緩沖液和待測物離子的電荷-體積比(Charge-size ratio)不同，進(jìn)而導(dǎo)致各離子在電場中遷移速率的差異。毛細(xì)管電泳正是利

6、用這種機(jī)理實(shí)現(xiàn)了待測物的分離。
　　 相較傳統(tǒng)電泳，毛細(xì)管電泳在25-100μm的彈性（聚酰亞胺）涂層熔融石英管中進(jìn)行樣品的分離和檢測，具有如下特點(diǎn):容積?。ㄒ桓?00 cm×75μm管子的容積僅4.4μL）;側(cè)面/截面積比大，因而散熱快、可承受高電場(100-1000 V/cm);可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì);在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。因此，對比其他傳統(tǒng)分析技術(shù)（如高效液相色譜法、紫外分光光度法、熒光法和紅外分光

7、光度法等），毛細(xì)管電泳有多、快、好、省這四方面優(yōu)勢。
　　 多——分離模式多。代表性技術(shù)有毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)，等電聚焦毛細(xì)管電泳(CIEF)，膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜(MEKC)和毛細(xì)管電色譜(CEC)等。
　　 快——分析時(shí)間相對較短。
　　 好——分離效率高、柱效好。
　　 省——樣品溶劑消耗極小，對環(huán)境污染破壞少。
　　 然而，由于技術(shù)的限制，毛細(xì)管電泳仍存在一定局限性。例如分離模式相對單一

8、，適用樣品范圍相對有限和重現(xiàn)性不足等等。為解決此類問題，眾多研究者提出了各自的改進(jìn)方案。如，在運(yùn)行緩沖液中添加膠束或是手性選擇劑以改善分離，采用壓力輔助，在毛細(xì)管中填充顆粒固定相，或是對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行修飾、鍵和等。這些努力在一定程度上提高了毛細(xì)管電泳的分離效率，拓展了相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用范圍。
　　 作為藥物分析領(lǐng)域的研究，本課題將著重于復(fù)雜體系的分離分析，結(jié)合前人經(jīng)驗(yàn)、復(fù)雜體系特點(diǎn)及毛細(xì)管電泳技術(shù)的優(yōu)勢，有針對性地將這類快速高效的分

9、析技術(shù)應(yīng)用于藥物分析研究中較難攻克的以中藥、體內(nèi)生物樣品為代表的復(fù)雜體系分析測定中。并在藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立、中藥指紋圖譜研究和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究以及治療藥物監(jiān)測等方面，做出可能的改進(jìn)和貢獻(xiàn)。
　　 毛細(xì)管電色譜技術(shù)(CEC)是一種結(jié)合了經(jīng)典液相色譜和毛細(xì)管電泳兩者優(yōu)點(diǎn)的分離技術(shù)，其中毛細(xì)管柱的制備是CEC的核心技術(shù)。毛細(xì)管填充柱是最為傳統(tǒng)和最為成熟的技術(shù)之一，流動(dòng)相通過包裹填料或填充聚合硅膠作為固定相的毛細(xì)管柱。但是這種色譜柱也存

10、在很多問題:一方面它需要豐富的填柱經(jīng)驗(yàn)和嫻熟的燒塞技術(shù);另一方面，塞子的引入又常常會(huì)在實(shí)驗(yàn)時(shí)導(dǎo)致氣泡產(chǎn)生，使電流中斷而影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。整體柱技術(shù)是在毛細(xì)管內(nèi)經(jīng)加熱和光照引發(fā)原位合成連續(xù)床層，因而不再需要在柱兩端燒塞子，操作也很簡單;同時(shí)可以根據(jù)不同樣品官能團(tuán)的需要，選擇不同的有機(jī)單體及添加劑進(jìn)行聚合。因此整體柱技術(shù)近來發(fā)展迅速，且被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、藥學(xué)、食品和環(huán)境領(lǐng)域。
　　 CEC相比HPLC的優(yōu)勢在于微流，這

11、保證了它們優(yōu)良的選擇性和靈敏度，以及低樣品和流動(dòng)相消耗。而CEC對比CE的優(yōu)勢在于不論待測物是否帶電均可分離，因?yàn)榇藭r(shí)待測物與固定相間的相互作用成為了可能。
　　 傳統(tǒng)CEC在微粒固定相中進(jìn)行，這造成一些問題，如需要填料。而整體固定相帶來了新的選擇，它無需填料且柱子易于制備。整體柱為點(diǎn)聚合制備，免去了微粒固定相煩瑣的填料過程。整體柱中液流通過聚合材料的大孔，與微粒固定相相比，帶來了質(zhì)量轉(zhuǎn)移效應(yīng)。
　　 在毛細(xì)管液相色譜中

12、，毛細(xì)管液相色譜柱是分離分析的核心，毛細(xì)管柱的制備是毛細(xì)管液相色譜的關(guān)鍵。毛細(xì)管液相色譜柱可根據(jù)固定相在柱內(nèi)的存在方式分為以下三種:開管毛細(xì)管液相色譜柱(open tubular capillary columns)、填充毛細(xì)管液相色譜柱（packed capillary columns）、整體毛細(xì)管液相色譜柱(monolithic capillarycolumns)。
　　 整體色譜柱(monolithic chromatog

13、raphic column)，又稱棒柱(rod)、連續(xù)床(continuous bed)，它是由單體、交聯(lián)引發(fā)劑、致孔劑的混合物在色譜柱內(nèi)通過原位聚合而成的連續(xù)床固定相，具有制備方法簡單、易于改性、柱效高、滲透性好、可進(jìn)行快速分離等優(yōu)點(diǎn)。整體柱按其制備方法的不同分為有機(jī)聚合物整體柱和無機(jī)整體柱兩類，雖然聚合物整體柱具有較好的重復(fù)性、化學(xué)選材范圍廣、易于制備、適用的pH值范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，但其存在溶脹、受熱變形，機(jī)械性能差等不足，并且孔徑及孔

14、徑分布難以控制。由自由基引發(fā)聚合而成的整體柱重復(fù)性差;紫外引發(fā)需紫外透明的毛細(xì)管，涂有聚四氟乙烯的石英管雖紫外透明，但聚四氟乙烯與毛細(xì)管結(jié)合不緊密，毛細(xì)管易斷。硅膠整體柱則在孔徑控制、機(jī)械性能、耐溶劑等方面顯示出一定的優(yōu)越性。
　　 綜上所述，基于整體柱技術(shù)的微分離分析方法具有高效率，高速度和較好選擇性等特點(diǎn)，但是綜合文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，這些技術(shù)在復(fù)雜體系特別是我們關(guān)心的中藥及生物樣品方面運(yùn)用仍然較少，但是它們的特點(diǎn)又決定了它們可以在

15、進(jìn)行優(yōu)化后運(yùn)用在這些領(lǐng)域，因此如何在現(xiàn)有較成熟技術(shù)的基礎(chǔ)上完善并轉(zhuǎn)化為實(shí)用是本課題的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。
　　 本研究具體包括如下工作:
　　 首先，我們對毛細(xì)管電色譜技術(shù)的沿革與發(fā)展進(jìn)行了較為全面的論述。為更為透徹、深刻地把握該項(xiàng)技術(shù)不同分支的優(yōu)缺點(diǎn)，有針對性地選擇適當(dāng)技術(shù)進(jìn)行復(fù)雜體系樣品的分離分析，我們對目前已經(jīng)研發(fā)出來的不同毛細(xì)管色譜柱技術(shù)，特別是較為通行的三種，即空管毛細(xì)管柱、填充毛細(xì)管柱和整體毛細(xì)管柱以及他們的修飾和改

16、進(jìn)進(jìn)行了調(diào)查與研究。通過它們各自特點(diǎn)的對比和適用范圍的確證，初步進(jìn)行有針對性的篩選和分類。同時(shí)也對毛細(xì)管電色譜技術(shù)的發(fā)展和特點(diǎn)進(jìn)行論述，緊緊圍繞效率的提升和混合分離機(jī)理的引入開展后續(xù)研究工作，為發(fā)掘此類技術(shù)的潛力作出努力。
　　 而后，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研和先期研究的經(jīng)驗(yàn)，我們選擇整體毛細(xì)管柱為本課題的主要研究方向。具體原因見相關(guān)章節(jié)闡述。針對白芷所含的多種香豆素成分，利用其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選取4個(gè)活性成分（歐前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯、發(fā)

17、卡二醇和異歐前胡素）進(jìn)行分離和測定。在經(jīng)過一定的電色譜條件優(yōu)化后，我們成功對上述化合物進(jìn)行了分離和定量測定。同時(shí)結(jié)果也證明，在電遷移和反相分配-吸附機(jī)理雙重作用之下，毛細(xì)管電色譜技術(shù)因?yàn)榧闪嗣?xì)管電泳和HPLC的技術(shù)特點(diǎn)，因此對于同時(shí)分離分析復(fù)雜體系內(nèi)多個(gè)組分非?？焖俸陀行АＨ绱艘粊?，便證明了毛細(xì)管電色譜技術(shù)特別是基于整體柱的毛細(xì)管電色譜技術(shù)，在分離分析復(fù)雜體系樣品方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 之后，我們發(fā)現(xiàn)，白芷提取液中仍

18、舊有數(shù)個(gè)活性成分無法分離，原因在于，雖然這些成分含量較大，但由于結(jié)構(gòu)非常類似，因此無論傳統(tǒng)高效液相色譜還是毛細(xì)管電色譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)它們的基線分離，特別是藥材基質(zhì)存在的情況下實(shí)現(xiàn)，是較為困難的。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用甲基丙烯酸丁酯整體柱，在一定電色譜條件下，能夠充分分離結(jié)構(gòu)相似的幾個(gè)化合物，并對其進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量測定。測定白芷的五個(gè)活性成分（花椒毒素、5-甲氧基-8-羥基補(bǔ)骨脂內(nèi)酯、香柑內(nèi)酯、水合氧化歐前胡素和白當(dāng)歸素）的過程中，還引入了去氧膽酸

19、鈉(SDC)作為“流動(dòng)固定相”。實(shí)踐證明，此膠束毛細(xì)管電色譜法對于結(jié)構(gòu)類似物的分離有著較大的優(yōu)勢。然而，此柱技術(shù)也存在一定局限性:一是樣品適應(yīng)性仍需提升。此類整體柱由于內(nèi)部結(jié)構(gòu)及所帶電荷的特征，多用于分離弱酸性和中性化合物，對堿性化合物實(shí)現(xiàn)分離極為困難。第二，也是相當(dāng)突出的問題在于，甲基丙烯酸丁酯由于碳鏈較短(C=4)，為保證柱效，往往必須聚合出極為緊密的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，這就使得柱通透性大打折扣。低通透性不但會(huì)帶來較高的背壓(＞1500psi

20、)，內(nèi)部多小孔的構(gòu)造也容易產(chǎn)生氣泡，進(jìn)而帶來電流中斷和容易堵塞等嚴(yán)重問題。故針后續(xù)研究必須針對此類問題進(jìn)行改進(jìn)。
　　 由于甲基丙烯酸丁酯整體柱已經(jīng)有較多應(yīng)用實(shí)例，且本課題組將其成功用于分離分析白芷中香豆素類似物。對于同樣含有大量香豆素成分的蛇床子，在一些方面仍有潛力可供挖掘。其中，蛇床子藥材的提取仍然停留在使用超聲、回流等傳統(tǒng)技術(shù)的階段，缺乏自動(dòng)化程度較高、提取快速高效的技術(shù)手段。加速溶劑萃取(ASE)提供了一個(gè)很好的解決方案

21、，大大提升了藥材的提取效率。在ASE的幫助下，樣品更為富集，純度也大大提升，實(shí)現(xiàn)了最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下對蛇床子素和歐前胡素的快速、同時(shí)測定。
　　 在成功進(jìn)行了兩種藥材活性成分的測定后，為拓展CEC的應(yīng)用前景，并測試其對體內(nèi)生物樣品分析的適應(yīng)性，我們將對蛇床子的研究深化到其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的監(jiān)測上來。選擇70％乙腈作為樣品溶劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所采集的血漿樣品使用蛋白沉淀法進(jìn)行前處理，而后測定目標(biāo)化合物的藥代動(dòng)力學(xué)曲線。結(jié)果顯示，甲基丙烯酸

22、酯毛細(xì)管整體柱在柱效、靈敏度和耐用性等方面符合體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求，能夠適用于體液樣品的分離分析。
　　 針對甲基丙烯酸丁酯整體柱存在的通透性較差，易產(chǎn)生氣泡等缺點(diǎn)，為適應(yīng)快速大通量分析并使整體柱實(shí)現(xiàn)在線沖洗，采用以硅膠-ADDA混合整體柱為技術(shù)基礎(chǔ)的新固定相。此類無機(jī)-有機(jī)混合整體柱，是有機(jī)固定相和硅膠基質(zhì)在催化劑作用下發(fā)生聚合反應(yīng)產(chǎn)生帶季氨基的陽離子單體。其電滲流特征與甲基丙烯酸丁酯整體柱類似，但機(jī)械強(qiáng)度更好，通透性極佳

23、，可完全實(shí)現(xiàn)柱上沖洗。此無機(jī)-有機(jī)混合整體柱被成功運(yùn)用于與在線微透析采樣技術(shù)結(jié)合，測定大鼠中頭孢地尼的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。同時(shí)，此技術(shù)與微透析采樣相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了在線、實(shí)時(shí)采樣和動(dòng)態(tài)監(jiān)測。結(jié)果顯示，此方法具有高自動(dòng)化、快速、高效、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。大大拓展了整體柱在復(fù)雜體系分析中的應(yīng)用。
　　 最后，在進(jìn)行了上述一系列研究之后，仍然有諸多問題沒有得到解決。諸如電色譜整體柱制備和保存較為麻煩，重現(xiàn)性不易保證，分析測定前的平衡需要