HBcAb陽(yáng)性供肝組織內(nèi)cccDNA檢測(cè)及與肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的關(guān)系.pdf

1、[目的]檢測(cè)乙肝核心抗體陽(yáng)性供肝組織內(nèi)HBVcccDNA，結(jié)合肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)率，探討HBcAb陽(yáng)性供肝中cccDNA與術(shù)后HBV復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　 [方法]實(shí)驗(yàn)分為兩部分。
　　 第一部分:建立檢測(cè)供肝組織中HBVcccDNA的熒光定量PCR檢測(cè)體系。根據(jù)入組病例的種族和地理分布特點(diǎn)，在GenBank選取HBV常見(jiàn)B、C基因型50株的全基因組序列，結(jié)合HBVrcDNA、HBVcccDNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇相對(duì)保守的序列設(shè)計(jì)

2、HBVcccDNA選擇性引物和探針。根據(jù)cccDNA的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特點(diǎn)，利用PSAD消化去除rcDNA和整合型HBVDNA的干擾后，利用跨越缺口的選擇性引物擴(kuò)增，延長(zhǎng)到探針結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，利用其外切酶活性將探針切斷，產(chǎn)生熒光信號(hào)。以pCP10質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，β-actin作為內(nèi)參照，對(duì)供肝組織提取的DNA樣本進(jìn)行PSAD消化后進(jìn)行cccDNA檢測(cè)，確定引物的最佳退火溫度和檢測(cè)靈敏度。
　　 第二部分:HBcAb陽(yáng)性供肝組織內(nèi)HBV

3、cccDNA的熒光定量PCR檢測(cè)與術(shù)后HBV的復(fù)發(fā)率的關(guān)系。2007年1月至2010年1月因乙肝相關(guān)性疾病在我院行肝移植手術(shù)患者1200例，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組、入選標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)，選取病例共85例，其中男性65例，女性20例，年齡18-65歲，平均為44.55±12.37歲，隨訪18-60個(gè)月，平均隨訪32.12±10.06個(gè)月。分為實(shí)驗(yàn)組（HBcAb陽(yáng)性供肝、HBsAg陰性，n=40）、對(duì)照組（HBsAg陽(yáng)性供肝，n=15）、正常組(無(wú)肝炎

4、供肝，n=30)三組。入選標(biāo)準(zhǔn):1）年齡18-65歲，性別不限;2）HBsAg或HBsAg和DNA陽(yáng)性;3）簽署知情同意;4）預(yù)計(jì)術(shù)后存活6個(gè)月以上者。排除標(biāo)準(zhǔn):1）術(shù)前血清學(xué)HBsAg陰性;2）預(yù)計(jì)術(shù)后生存期＜6個(gè)月者;3）存在其它肝炎病毒混合感染;4）HBV病毒變異者;5）嚴(yán)重藥物過(guò)敏者。利用第一部分創(chuàng)建的方法，檢測(cè)供肝組織內(nèi)的HBVcccDNA。所有患者肝移植術(shù)后給予HBIG聯(lián)合核苷類藥物預(yù)防乙肝復(fù)發(fā)方案。定期檢測(cè)HBV血清學(xué)及H

5、BVDNA，如有HBsAg陽(yáng)性或HBV-DNA陽(yáng)性者取肝穿活檢病理確認(rèn)復(fù)發(fā)。計(jì)算乙肝復(fù)發(fā)率，探討HBcAb陽(yáng)性供肝中cccDNA與術(shù)后HBV復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行x2檢驗(yàn)。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 第一部分:成功建立了檢測(cè)供肝組織中HBVcccDNA的熒光定量PCR檢測(cè)體系。
　　 第二部分:入組患者共85例，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及正常組

6、分別有12例、11例和0例cccDNA檢測(cè)呈陽(yáng)性，其陽(yáng)性率分別為30％(12/40)、73.3％(11/15)、0。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的HBVcccDNA陽(yáng)性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.419P=0.004)。
　　 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及正常組術(shù)后HBV的復(fù)發(fā)率分別為10％(4/40)、80％(12/15)和3.3％(1/30)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后HBV的復(fù)發(fā)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=25.913P＜0.001)。實(shí)驗(yàn)組、正常組術(shù)

7、后HBV的復(fù)發(fā)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.149P=0.284)。實(shí)驗(yàn)組cccDNA(+)與cccDNA(-)的供肝術(shù)后HBV的復(fù)發(fā)率分別為7.5％(3/40)、2.5％(1/40)，術(shù)后HBV復(fù)發(fā)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.286P=0.038)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、成功建立了檢測(cè)供肝組織中HBVcccDNA的MGB探針熒光定量PCR方法，可用于石蠟組織中供肝內(nèi)HBVcccDNA的檢測(cè)。