Akt對CSN6的上調(diào)作用及Akt-CSN6軸對NSCLC惡性生長的影響.pdf

1、研究背景：
　　 CSN6是近幾年受到關(guān)注的致癌蛋白，在細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其在乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。CSN6的主要功能為通過調(diào)控蛋白質(zhì)的泛素化而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而影響蛋白質(zhì)的功能。文獻(xiàn)報(bào)道，CSN6對MDM2-p53軸及COP1-14-3-3σ軸有重要的調(diào)節(jié)作用，并由此促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。人體內(nèi)CSN6的蛋白水平和腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，但其上游分子目前尚不清楚。A

2、kt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，為人體內(nèi)重要的腫瘤調(diào)節(jié)因子，對多種下游分子起調(diào)節(jié)作用，其在EGF、IGF等生長因子傳導(dǎo)通路上發(fā)揮重要作用，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。盡管目前對Akt的研究頗多，但對其下游分子并未完全了解。Akt與CSN6同為細(xì)胞周期、MDM2-p53軸和DNA損傷反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，但兩者的關(guān)系目前尚不清楚，既往有研究提示Akt可能對CSN某些亞復(fù)合體有調(diào)節(jié)作用，但具體哪個(gè)亞單位，并不清楚。我們用NetPhos algorithm(

3、http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)系統(tǒng)比對出CSN6具有Akt激酶的磷酸化模序，因此推測Akt可磷酸化CSN6，但此尚需要大量的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。
　　 研究目的：
　　 1.探討Akt激酶是否對CSN6蛋白水平有調(diào)節(jié)作用。
　　 2.探討Akt激酶對CSN6水平調(diào)節(jié)的機(jī)制。
　　 3.探討Akt-CSN6軸對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)惡性生長的影響。
　　

4、 材料及方法：
　　 1.Akt激酶過表達(dá)對外源性CSN6水平的影響
　　 對293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒，48小時(shí)后對細(xì)胞進(jìn)行GFP熒光檢測及收集蛋白進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。
　　 2.Akt激酶過表達(dá)對內(nèi)源性CSN6水平的影響
　　 選擇Rat-1細(xì)胞，建立Akt穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(Rat-1 Akt細(xì)胞株)及空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(Rat-1細(xì)胞株)，收集蛋白

5、，進(jìn)行Western Blot，比較兩組細(xì)胞CSN6蛋白的含量。
　　 3.抑制Akt激酶活性對CSN6水平的影響
　　 選擇MDA-MB453細(xì)胞，建立陽性負(fù)調(diào)節(jié)突變型Akt(Dominant Negative Akt，DN-Akt)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(MDA-MB453 DN-Akt細(xì)胞株)及空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(MDA-MB453)，收集蛋白，進(jìn)行Western Blot，比較兩組細(xì)胞CSN6蛋白的含量。對293T細(xì)胞

6、，共轉(zhuǎn)染Flag-CSN6及HA-Akt質(zhì)粒，同時(shí)用PI3K抑制劑LY294002(終濃度50μM)處理細(xì)胞，6小時(shí)后，檢測CSN6蛋白含量，比較用藥組及對照組CSN6蛋白的水平。
　　 4.Akt激酶對CSN6核轉(zhuǎn)位的影響
　　 對U20S細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及HA-Akt質(zhì)粒，72小時(shí)后，用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測GFP-CSN6亞細(xì)胞內(nèi)分布情況。同樣方法，觀察Rat-1-Akt細(xì)胞CSN6亞細(xì)胞分布情況。
　

7、　 5.Akt激酶對CSN6蛋白降解率的影響
　　 對293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6和HA-Akt質(zhì)粒，24小時(shí)后，加蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)(終濃度60μg/ml)培養(yǎng)，分別于加藥后1、2及4小時(shí)，收集細(xì)胞，進(jìn)行Western Blot，檢測CSN6蛋白含量。用Image J軟件計(jì)算CSN6蛋白降解率。
　　 6.Akt激酶對CSN6泛素化的影響
　　 對293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6、H

8、A-ubiquitin及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒，6小時(shí)后加入蛋白酶體抑制劑MG132培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取蛋白，每組取1g蛋白(500μl蛋白提取物)用抗GFP抗體進(jìn)行免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)，用抗泛素抗體對免疫沉淀物進(jìn)行Western Blot，以測定CSN6泛素化水平。
　　 7.Akt激酶與CSN6蛋白的結(jié)合
　　 構(gòu)建Flag-CSN6-全長片段(Full-leng

9、th CSN6)、Flag-CSN6-N端片段(氨基酸41-171)(N terminus ofCSN6)及Flag-CSN6-C端片段(氨基酸194-321)(C-terminus ofCSN6)質(zhì)粒，將3種片段的質(zhì)粒分別與HA-Akt質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后，收集細(xì)胞，每組細(xì)胞取2g蛋白(500μl蛋白提取物)進(jìn)行免疫共沉淀，用抗-Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀，用抗HA抗體對免疫沉淀物進(jìn)行WesternBlot，檢測Akt激酶

10、和CSN6蛋白的結(jié)合狀態(tài)。
　　 8.Akt激酶磷酸化CSN6
　　 構(gòu)建能在大腸桿菌中高表達(dá)蛋白的pET-Flag-CSN6-WT及pET-Flag-CSN6-S60A質(zhì)粒，提取Flag-CSN6-WT及Flag-CSN6-S60A重組蛋白，配制激酶反應(yīng)體系，用同位素法進(jìn)行Akt激酶體外激酶活性測定，檢測加入Akt激酶后各組CSN632P的放射活性。
　　 9.Serine60突變后Akt激酶對CSN6水平、降

11、解率及泛素化的影響
　　 (1)構(gòu)建myc-CSN6野生型質(zhì)粒，并用QuickChange定點(diǎn)突變系統(tǒng)獲得myc-CSN6 S60A突變型和myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒。
　　 (2)對293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型和myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒，48小時(shí)后收集蛋白，進(jìn)行WesternBlot，檢測各組CSN6含量。
　　 (3)對29

12、3T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒，24小時(shí)后加入Cycloheximide(終濃度60μg/ml)培養(yǎng)，分別于處理后1、2、4小時(shí)，收集細(xì)胞，進(jìn)行Western Blot，檢測CSN6蛋白降解率。
　　 (4)對293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Ak

13、t質(zhì)粒，6小時(shí)后加入蛋白酶體抑制劑MG132，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，用抗myc抗體進(jìn)行免疫沉淀，用抗泛素抗體對免疫沉淀物進(jìn)行Western Blot，以測定CSN6泛素化水平。
　　 10.Akt激酶對CSN6轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 對293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒，48小時(shí)后收集RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，測定CSN6mRNA水平，以GAPDH作為

14、內(nèi)參，用相對定量法的2-△△CT值比較組間表達(dá)的差異。
　　 11.Akt激酶對CSN6介導(dǎo)的MDM2及p53降解的影響
　　 對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒，48小時(shí)后收集蛋白用抗-MDM2及抗p53抗體進(jìn)行Western Blot，檢測MDM2及p53蛋白水平。
　　 12.Akt激酶對CSN6

15、介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞DNA損傷的影響
　　 對HCT116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染野生型CSN6，測定細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)氧自由基(ROS)及7-H2AX水平變化，此外，在轉(zhuǎn)染的同時(shí)加入LY294002處理，重復(fù)上述測定。
　　 13.Akt激酶對CSN6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞增殖能力的影響
　　 對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt

16、質(zhì)粒，24小時(shí)后，將細(xì)胞分別接種到6孔及96孔板，分別進(jìn)行MTS實(shí)驗(yàn)、平板集落形成實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂非錨定依賴性克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測Akt激酶對CSN6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞惡性生長能力的影響。
　　 14.肺癌組織Akt激酶與CSN6蛋白表達(dá)的相關(guān)性
　　 選擇非小細(xì)胞肺癌患者肺癌組織芯片，兩張芯片共有40例配對的肺癌組織，用免疫組化LSA法分別檢測CSN6及P-Akt(473)表達(dá)水平，使用H-score半定量法判定信號(hào)的強(qiáng)弱

17、，分析CSN6與P-Akt(473)蛋白水平的相關(guān)性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.Akt激酶對CSN6水平的影響
　　 (1)Akt激酶過表達(dá)上調(diào)外源性CSN6水平：293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒后，Western Blot及GFP熒光檢測均顯示加入Akt后，293T細(xì)胞內(nèi)CSN6水平明顯增加，且隨著Akt濃度的升高而逐漸增加。
　　 (2)Akt激酶過表達(dá)上調(diào)內(nèi)源性CS

18、N6水平：高表達(dá)AKT的Rat-1 Akt細(xì)胞穩(wěn)定株(Rat-1-Akt)CSN6水平明顯高于對照組Rat-1細(xì)胞株的CSN6含量。
　　 (3)抑制Akt激酶活性下調(diào)CSN6水平：MDA-MB453-DN-Akt細(xì)胞CSN6水平明顯低于對照組MDA-MB453細(xì)胞株。293T細(xì)胞受PI3K抑制劑LY294002處理后，CSN6水平明顯降低。
　　 (4)肺癌組織Akt激酶與CSN6蛋白的表達(dá)相關(guān)：40例非小細(xì)胞肺癌組織

19、中，P-Akt高表達(dá)的23例，其中CSN6高表達(dá)的為15例(65.22％)，低表達(dá)的為8例(34.78％)；P-AKT低表達(dá)的17例，其中CSN6高表達(dá)的為5例(29.41％)，低表達(dá)的為12例(70.58％)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CSN6的表達(dá)水平與P-Akt(473)的表達(dá)水平明顯正相關(guān)。
　　 2.Akt激酶對CSN6核轉(zhuǎn)位的影響
　　 U2OS細(xì)胞共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不HA-Akt質(zhì)粒后

20、，免疫熒光檢測顯示加入Akt組CSN6亞細(xì)胞分布由細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，同樣AKT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Rat-1細(xì)胞CSN6亞細(xì)胞也分布發(fā)生由漿到核的轉(zhuǎn)移。
　　 3.Akt激酶對CSN6蛋白降解率的影響
　　 293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及HA-Akt質(zhì)粒并用并加蛋白合成抑制劑Cycloheximide處理1、2、4小時(shí)后，CSN6蛋白降解率測定顯示：轉(zhuǎn)染Akt組CSN6蛋白的降解速度較未轉(zhuǎn)染組明顯減慢，而MDA-MB4

21、53-DN-Akt細(xì)胞CSN6蛋白降解速度較未轉(zhuǎn)染組明顯加快，Image J軟件計(jì)算結(jié)果顯示0、1、2及4小時(shí)CSNA6/Vector組蛋白降解率分別為100％，50％，55％及0，而CSN6/HA-Akt組分別為100％，110％，100％及95％，說明Akt激酶可抑制CSN6蛋白的降解。
　　 4.Akt激酶對CSN6泛素化的影響
　　 293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6、HA-ubiquitin及不同濃度的HA-A

22、kt質(zhì)粒后，加入Akt組293T細(xì)胞內(nèi)CSN6泛素化水平明顯降低，且隨著Akt濃度的增加而降低更明顯。說明Akt激酶可抑制CSN6的泛素化。
　　 5.Akt激酶與CSN6蛋白的結(jié)合
　　 293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染HA-Akt及Flag-CSN6-全長片段、Flag-CSN6-N端片段及Flag-CSN6-C端片段質(zhì)粒后，免疫共沉淀結(jié)果顯示，Akt激酶和CSN6蛋白直接結(jié)合在一起，而與C端片段相比，與N端片段具有更明顯的結(jié)合能

23、力。
　　 6.Akt激酶磷酸化CSN6
　　 同位素體外激酶活性測定結(jié)果顯示加入Akt激酶組的CSN6顯示32P的放射活性，而未加入Akt激酶的CSN6無放射活性，說明Akt激酶可磷酸化CSN6蛋白。
　　 7.Akt激酶磷酸化CSN6的位點(diǎn)為Serine60
　　 (1)同位素體外激酶活性測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：加入Akt激酶后，CSN6 S60A突變型組的CSN632P放射活性明顯低于野生型CSN6組，說

24、明CSN6的S60位點(diǎn)是Akt激酶的作用位點(diǎn)之一。
　　 (2)293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)CSN6水平測定結(jié)果顯示：myc-CSN6S60D突變型組CSN6水平明顯增高，myc-CSN6野生型組次之，CSN6 S60A突變型組無明顯改變。
　　 (3)293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6

25、 S60A突變型及myc-CSN6S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)CSN6蛋白降解率測定結(jié)果顯示：myc-CSN6 S60D突變型組CSN6的降解明顯減慢，myc-CSN6野生型組次之，CSN6 S60A突變型組無明顯改變。
　　 (4)293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后，CSN6泛素化水平測定結(jié)果顯示：myc-CSN

26、6-S60D突變型組CSN6泛素化水平明顯減低，myc-CSN6野生型組次之，CSN6 S60A突變型組無明顯改變。
　　 8.Akt激酶對CSN6轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒后，結(jié)果顯示加入Akt組293T細(xì)胞內(nèi)CSN6 mRNA水平增加，且隨著Akt濃度的增加而逐漸增加，說明Akt激酶對CSN6的轉(zhuǎn)錄也有一定的促進(jìn)作用。
　　 9.Akt激酶對CSN6介

27、導(dǎo)的MDM2及p53降解的影響
　　 A549細(xì)胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后，MDM2及p53水平測定結(jié)果顯示myc-CSN6S60D突變型組MDM2水平明顯增高，myc-CSN6野生型組次之，CSN6 S60A突變型組改變不明顯。myc-CSN6 S60D突變型組p53蛋白水平明顯降低，myc-CSN6野生型組次之，myc-CSN6 S

28、60A突變型組無明顯改變。
　　 10.Akt激酶對CSN6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞DNA損傷的影響
　　 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型CSN6后，γ-H2AX點(diǎn)數(shù)較對照組明顯增加，而當(dāng)轉(zhuǎn)染的同時(shí)加入LY294002后γ-H2AX點(diǎn)數(shù)較對照組明顯減少。
　　 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型CSN6后，DCF測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CSN6的細(xì)胞ROS形成率明顯較對照組增加，而當(dāng)轉(zhuǎn)染的同時(shí)加入LY294002后ROS形成率較未加LY

29、294002組明顯減少。
　　 11.Akt激酶提高CSN6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞增殖能力
　　 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型及HA-Akt質(zhì)粒后，MTS測定結(jié)果顯示myc-CSN6S60D突變型組細(xì)胞增殖率明顯增高，myc-CSN6野生型組次之，CSN6 S60A突變型組無明顯改變，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明Akt激酶對CS

30、N6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞增殖能力具有提高作用。
　　 12.Akt激酶提高CSN6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞平板集落形成能力
　　 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后，平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示myc-CSN6 S60D突變型組細(xì)胞集落形成率明顯增高，myc-CSN6野生型組次之，CSN6 S60A突變型組無明顯改變，三

31、組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明Akt激酶對CSN6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞非密度依賴生長能力具有提高作用。
　　 13.Akt激酶提高CSN6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力
　　 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Ala質(zhì)粒后，軟瓊脂非錨定依賴性克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSN6 S60D突變型組細(xì)胞軟瓊脂非錨定克隆形成率明顯

32、增高，CSN6野生型組次之，CSN6 S60A突變型組無明顯改變，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明Akt激酶對CSN6介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞非錨定依賴性生長能力具有提高作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.Akt激酶抑制CSN6的降解，上調(diào)CSN6水平。
　　 2.Akt激酶抑制CSN6降解的機(jī)制為，Akt激酶與CSN6結(jié)合，磷酸化CSN6，使CSN6的泛素化降低。
　　 3.Akt激酶磷酸化CSN6的位點(diǎn)為Se