PI3K-Akt信號途徑及MPTP介導(dǎo)七氟醚后處理腦保護機制的探討.pdf

1、本課題首先通過觀察缺血后大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況、測定腦梗死容積百分比、HE染色評價缺血側(cè)皮層的神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變及Nissl染色進行缺血半影區(qū)存活神經(jīng)細胞計數(shù)，明確不同濃度的七氟醚后處理是否對Sprague-Dawley大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用；其次，第二部分通過加入特異性MPTP開放劑和PI3K/Akt通道阻斷劑，觀察缺血后大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況、測定腦梗死容積百分比，分光光度法測定各組缺血皮層半影區(qū)神經(jīng)元MPTP的開放度，測定

2、半影區(qū)磷酸化的Akt、磷酸化的糖原合成激酶3β的表達，探討七氟醚后處理的腦保護效應(yīng)可能是通過激活PI3K/Akt/GSK-3β途徑，增加p-Akt,p-GSK-3β的表達，抑制MPTP的開放而介導(dǎo)的。隨后，第三部分通過計數(shù)缺血半影區(qū)的凋亡細胞和Caspase-3,8,9陽性細胞，證實七氟醚后處理可能通過對PI3K/Akt途徑和MPTP進行調(diào)控，抑制線粒體凋亡途徑，從而減少神經(jīng)細胞的死亡。最后通過檢測半影區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管內(nèi)皮生長

3、因子的表達，推測七氟醚后處理有可能通過上調(diào)BDNF和VEGF的水平，進而促進神經(jīng)干細胞的激活和新生血管的形成，有利于神經(jīng)功能的重建和修復(fù)。結(jié)果證實：(1)腦缺血再灌注的同時吸入2.4％及4.0％的七氟醚進行后處理具有腦保護作用，但是未發(fā)現(xiàn)七氟醚后處理在本實驗?zāi)Ｐ椭械谋Ｗo效應(yīng)具有劑量依賴性。(2)七氟醚后處理可通過激活PI3K/Akt/GSK-3β途徑，促進Akt的活化，增加p-GSK-3β的表達，進而抑制MPTP的開放，降低腦缺血再灌注

4、損傷。(3)七氟醚后處理可通過抑制線粒體凋亡途徑，減少腦缺血再灌注造成的神經(jīng)元死亡，發(fā)揮顯著的腦保護作用。其機制可能與激活PI3K/Akt途徑，抑制MPTP的開放有關(guān)。(4)七氟醚后處理可通過上調(diào)BDNF和VEGF的水平，參與神經(jīng)保護作用。
　　 第一部分七氟醚后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用
　　 目的：觀察腦缺血再灌注的同時吸入2.4％或4.0％的七氟醚60min是否會產(chǎn)生腦保護效應(yīng)。
　　 方法：健康

5、雄性SD大鼠，體重300～350g，隨機分為四組：假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注＋2.4％七氟醚1組，缺血再灌注＋4.0％七氟醚2組。電凝法進行左側(cè)大腦中動脈永久性阻斷，雙側(cè)頸總動脈阻斷60min后松開，造成腦缺血再灌注，氣管插管，再灌注的同時，機械通氣，吸入2.4％或4％的七氟醚＋氧氣，連續(xù)吸入60min。Sham組開顱，暴露大腦中動脈，但不燒灼，分離兩側(cè)頸總動脈，但不夾閉，氣管插管，吸入100％純氧60min；I/R組再灌注的同

6、時吸入100％純氧60min。各組在麻醉后5min、大腦中動脈永久性阻斷后15min及再灌注后15min分別記錄平均動脈壓、心率、體溫，并抽動脈血，行血氣分析。于再灌注1d、3d、7d，用神經(jīng)功能評分觀察動物神經(jīng)行為學(xué)的變化、HE染色評價缺血側(cè)皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的改變及Nissl染色進行缺血半影區(qū)存活神經(jīng)元計數(shù)。于再灌注3d，運用2,3,5-三苯基氯化四氮唑法測定大鼠腦梗死容積百分比。
　　 結(jié)果：與Sham組相比，除了Sevo2

7、組在再灌注15min的MAP值降低之外，其余各組pH值、動脈血二氧化碳分壓、動脈血氧分壓、平均動脈壓及體溫差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與I/R組相比，再灌注1d、3d、7d，神經(jīng)功能評分顯示Sevol組和Sevo2組均能明顯改善神經(jīng)功能，Nissl染色顯示Sevol組和Sevo2組均能顯著增加缺血半影區(qū)存活神經(jīng)細胞的數(shù)量，再灌注3d，TTC染色法顯示，Sevol組和Sevo2組腦梗死容積百分比較I/R組顯著減少。但Sevol組和Sevo2組的神經(jīng)

8、功能評分、半影區(qū)存活神經(jīng)細胞數(shù)目及腦梗死容積比之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：七氟醚后處理能明顯改善腦缺血后的神經(jīng)功能，減少梗死容積，增加神經(jīng)細胞的存活，產(chǎn)生有效的腦保護效應(yīng)。但未證實七氟醚后處理在本模型中的保護效應(yīng)具有劑量依賴性。
　　 第二部分 PI3K/Akt/GSK-3β信號途徑及MPTP在七氟醚后處理介導(dǎo)的腦保護效應(yīng)中的作用
　　 目的：探討PI3K/Akt/GSK-3β信號途徑及MPTP在七氟醚

9、后處理腦保護效應(yīng)中的作用。
　　 方法：健康雄性SD大鼠，體重300～350g，隨機分為八組：假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注＋七氟醚組，缺血再灌注＋DMSO組，缺血再灌注＋七氟醚＋MPTP特異性開放劑Atractyloside組，缺血再灌注＋七氟醚＋PI3K特異性抑制劑LY294002組，缺血再灌注＋Atractyloside組，缺血再灌注＋LY294002組。缺血再灌注模型為pMCAO＋夾閉雙側(cè)頸總動脈60min。再灌注的

10、同時，予2.4％的七氟醚持續(xù)吸入60min，進行七氟醚后處理。Sham組開顱，暴露大腦中動脈，但不燒灼，分離兩側(cè)頸總動脈，但不夾閉，氣管插管，吸入100％純氧60min；I/R組再灌注的同時吸入100％純氧60min。Atractyloside1.6mg/mL，30μL，溶于DMSO中，再灌注的前10min側(cè)腦室給藥。LY2940021.7mg/mL，30μL，溶于DMSO中，再灌注的前10min側(cè)腦室給藥。于再灌注1d、3d、7d，用

11、神經(jīng)功能評分觀察動物神經(jīng)行為學(xué)的變化。再灌注3d，運用TTC法測定大鼠腦梗死容積百分比，分光光度法測定各組大鼠缺血皮層半影區(qū)神經(jīng)元MPTP的開放度。再灌注6h、1d、3d、7d取大鼠缺血側(cè)頂葉皮層半影區(qū)，Western Blot檢測p-Akt、p-GSK-3β的表達。
　　 結(jié)果：與I/R組相比，七氟醚后處理能緩解大鼠腦缺血再灌注損傷后Ca2＋誘導(dǎo)的的下降，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)，減少腦梗死容積。而MPTP特異性開放劑Atracty

12、loside和PI3K特異性抑制劑LY294002能拮抗七氟醚的腦保護效應(yīng)，單獨使用DMSO、Atractyloside及LY294002則無明顯影響。與I/R組相比，七氟醚后處理能增加各時點Akt-Ser473和GSK-3β-Ser9磷酸化的表達。七氟醚的此效應(yīng)也可以被PI3K特異性抑制劑LY294002所廢止。
　　 結(jié)論：七氟醚后處理可通過激活PI3K/Akt/GSK-3β途徑，促進Akt的活化，增加p-GSK-3β的表達

13、，進而抑制MPTP的開放，降低腦缺血再灌注損傷。
　　 第三部分七氟醚后處理對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡的影響及機制
　　 目的：觀察七氟醚后處理對腦缺血再灌注缺血半影區(qū)Caspase-3,8,9的影響以及MPTP與細胞凋亡的關(guān)系。
　　 方法：健康雄性SD大鼠，體重300～350g，隨機分為七組：假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注＋七氟醚組，缺血再灌注＋七氟醚＋MPTP特異性開放劑Atractyloside組，

14、缺血再灌注＋七氟醚＋PI3K特異性抑制劑LY294002組，缺血再灌注＋Atractyloside組，缺血再灌注＋LY294002組。缺血再灌注模型為pMCAO＋夾閉雙側(cè)頸總動脈60min。再灌注的同時，予2.4％的七氟醚持續(xù)吸入60min，進行七氟醚后處理。于再灌注1d、3d、7d對缺血半影區(qū)進行觀察，原位末端標(biāo)記法檢測神經(jīng)元的凋亡情況，免疫組化法計數(shù)Caspase-3,8,9的陽性細胞數(shù)量。
　　 結(jié)果：Sham組大腦皮質(zhì)中

15、未見明顯凋亡細胞，神經(jīng)元中Caspase-3,8,9的表達也極少。與Sham組相比，缺血再灌注組半影區(qū)的凋亡細胞、Caspase-3,8,9陽性細胞數(shù)目明顯增多。與I/R組相比，七氟醚后處理能減少各時點半影區(qū)的神經(jīng)元凋亡，降低Caspase-3,9的表達，但對Caspase-8的表達無明顯影響。同樣，MPTP特異性開放劑Atractyloside和PI3K特異性抑制劑LY294002可以廢除七氟醚后處理抑制凋亡的效應(yīng)。
　　 結(jié)

16、論：七氟醚后處理可通過抑制線粒體凋亡途徑，減少腦缺血再灌注造成神經(jīng)元的死亡，發(fā)揮顯著的腦保護作用。其機制可能與激活PI3K/Akt途徑，抑制MPTP的開放有關(guān)。
　　 第四部分七氟醚后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后BDNF、VEGF的影響
　　 目的：觀察七氟醚后處理對腦缺血再灌注后缺血側(cè)頂葉皮層半影區(qū)BDNF和VEGF的影響。
　　 方法：健康雄性SD大鼠，體重300～350g，隨機分為三組：假手術(shù)組，缺血再灌注

17、組，缺血再灌注＋七氟醚組。缺血再灌注模型為pMCAO＋夾閉雙側(cè)頸總動脈60min。再灌注的同時，予2.4％的七氟醚持續(xù)吸入60min，進行七氟醚后處理。于缺血再灌注的6h、1d、3d、7d，用RT-PCR和Western blot檢測缺血側(cè)頂葉皮層半影區(qū)BDNF和VEGF的表達。
　　 結(jié)果：Sham組腦皮質(zhì)中僅有少量的BDNF和VEGF表達。與Sham組相比較，缺血再灌注組BDNF和VEGF的表達均于再灌注后6h開始增加，1d