Dickkopf-1蛋白與經(jīng)典Wnt信號通路失活在帕金森病模型中的作用研究.pdf

1、第一部分經(jīng)典Wnt信號通路失活在MPP+所致PC12細胞損失中的作用研究
　　目的:Wnt信號通路在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育及帕金森病多巴胺能神經(jīng)元的損傷中發(fā)揮著重要作用。本研究旨在觀察經(jīng)典Wnt信號通路的相關蛋白及其抑制劑Dkk1是否在MPP+誘導的PC12細胞中發(fā)生改變,并初步探討其可能機制。
　　方法:用不同濃度的MPP+作用于PC12細胞,MTT法檢測在不同時間細胞的存活率及Western Blot檢測不同時間點Dkk1

2、、β-catenin和p-Ser9-GSK-3β表達的變化情況。LiCl預處理1h后,再用MPP+作用PC12細胞,同時也檢測細胞的存活率及凋亡的情況,檢測不同時間點Dkk1、β-catenin和p-Ser9-GSK-3β表達的變化情況。
　　結果:①不同濃度的MPP+對PC12細胞作用24h,細胞存活率沒有顯著變化,高濃度的MPP+對PC12細胞作用48h和72h后細胞存活率有顯著變化,并且在1000μM MPP+作用72h后,

3、細胞存活率降至最低45.0％,而1000μM MPP+作用48h和72h對細胞存活率的影響并沒有顯著性差異。②Western Blot結果顯示,在6-24h,MPP+誘導Dkk1的表達顯著增加,其表達高峰時間先于細胞的死亡時間,但是Dkk1的水平在48h恢復至正常。MPP+作用8h后,β-catenin的水平開始有降低的趨勢,在24h至48h其水平則顯著降低,p-Ser9-GSK-3β(GSK-3β的非活化形式)在MPP+作用6-48h

4、減少。③LiCl預處理可顯著增加PC12細胞中β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的表達。④LiCl預處理減輕MPP+誘導的PC12細胞存活率的減少,Annexin V-FITC/PI流式細胞術及TUNEL法顯示MPP+誘導的PC12細胞凋亡率的增加也可被LiCl(1mM)減少。
　　結論:經(jīng)典Wnt信號通路蛋白和其抑制劑Dkk1可能參與了MPP+對 PC12細胞的增殖抑制作用,Dkk1可能通過抑制經(jīng)典Wnt信號通路蛋白

5、而發(fā)揮作用。
　　第二部分Dickkopf-1在MPP+所致PC12細胞損傷中的作用
　　目的:第一部分實驗表明Dkk1在MPP+致PC12細胞損傷模型中的誘導表達先于細胞死亡,本實驗旨在探討Dkk1在MPP+致PC12細胞損傷模型中的機制。
　　方法:通過對外源性的給予rhDkk1聯(lián)合MPP+處理PC12細胞48h后,檢測細胞存活率及Wnt信號通路相關蛋白表達的變化情況。通過siRNA技術下調(diào)Dkk1在PC12細胞的

6、表達,觀察細胞凋亡情況及Wnt信號通路相關蛋白表達的變化情況。
　　結果:①rhDkk1(100 ng/ml)與MPP+聯(lián)合作用細胞48h后檢測細胞存活率,結果顯示:rhDkk1加重MPP+對PC12細胞的損傷作用,而LiCl預處理1h并不能顯著改善兩者聯(lián)合應用引起的細胞損傷作用。②rhDkk1促進MPP+誘導的PC12細胞中TH的減少。與MPP+單獨處理組相比,兩者聯(lián)合應用β-catenin減少的更多,但p-Ser9-GSK-3

7、β輕微減少。③Dkk1-siRNA可以顯著減輕MPP+誘導的PC12細胞的凋亡。④Dkk1-siRNA有效的增加β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的表達,同時也顯著提高TH的水平。
　　結論:Dkk1參與了MPP+誘導的PC12細胞的凋亡,其機制可能與抑制經(jīng)典Wnt信號通路相關。
　　第三部分Dickkopf-1在6-OHDA損傷大鼠的帕金森病模型中的作用
　　目的:本實驗旨在觀察Dkk1在6-OHDA損傷

8、大鼠的帕金森病模型中的作用。
　　方法:通過腦立體定位儀經(jīng)MFB給予6-OHDA損傷大鼠,制備帕金森病模型。另有LiCl預處理7d后再給予6-OHDA損傷大鼠組,及通過黑質(zhì)給予rhDkk1與MFB給予6-OHDA聯(lián)合損傷大鼠組。術后35d多聚甲醛灌注免疫組化檢測各組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷情況,并取大鼠腹側中腦Western Blot檢測TH、Dkk1及β-catenin、p-Ser9-GSK-3β的變化情況。
　　結果:①

9、6-OHDA損傷組TH陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,LiCl預處理組的TH陽性的神經(jīng)元數(shù)量則明顯增加;rhDkk1與6-OHDA聯(lián)合損傷組,與6-OHDA單獨損傷組相比,TH陽性的神經(jīng)元數(shù)量則降低的更明顯。②Dkk1在6-OHDA損傷的大鼠術后35d腹側中腦的表達明顯增加。③經(jīng)典Wnt信號通路的抑制在6-OHDA損傷的大鼠腹側中腦中也被檢測到,包括β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的降低,而兩者表達水平均可被LiCl升高;rhD