肝臟缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞脹亡及附子多糖對(duì)其防治作用的研究.pdf

1、本研究擬在HIRI大鼠模型預(yù)防性使用附子多糖，觀察它對(duì)HIRI大鼠的肝臟保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。研究結(jié)果為進(jìn)一步完善中草藥多糖活性組分的藥物應(yīng)用價(jià)值開發(fā)，為中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理研究提供參考，為進(jìn)一步開發(fā)新藥和臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為HIRI防治提供新的有效藥物。 第一部分：大鼠肝臟缺血再灌注損傷與細(xì)胞脹亡的關(guān)系 材料與方法： 1.肝缺血再灌注損傷模型的制作 16只SD大鼠隨機(jī)分為兩組：假手

2、術(shù)組和模型組，每組8只。動(dòng)物麻醉開腹后阻斷供應(yīng)大鼠肝左、中葉的門靜脈和肝動(dòng)脈分支60min，松夾恢復(fù)左、中肝灌流。120min后取頸動(dòng)脈血10ml，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶檢測、膽堿脂酶和白蛋白。 2.檢測指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取肝臟組織塊，行Hitachi透射電子顯微鏡觀察。制作肝細(xì)胞懸液，Annexin V—FITC/PI免疫熒光染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。肝臟組織進(jìn)行Caspase—3、T

3、UNEL免疫熒光染色。 結(jié)果： 1.肝臟酶學(xué)檢測結(jié)果 假手術(shù)組血漿肝臟酶AST、ALT、LDH、CHE水平分別為169.8 U/L、67.1 U/L、901.0 U/L、166.8U/L，模型組的分別為2178.4 U/L、1347.9 U/L、5148.0 U/L、448.6U/L。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝臟酶AST、ALT、LDH、CHE均明顯增高，兩組比較差別有顯著性。 2.電子顯微鏡檢測結(jié)果

4、 透射電子顯微鏡檢測假手術(shù)組肝細(xì)胞正常，模型組可見較多數(shù)的脹亡細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。 3.Annexin V—FITC/PI免疫熒光染色流式細(xì)胞儀檢測肝臟細(xì)胞凋亡、脹亡結(jié)果 假手術(shù)組脹亡細(xì)胞和凋亡細(xì)胞百分比分別是0.15％和0.65％，模型組的百分比均升高，為24.55％和14.99％。而模型組正常細(xì)胞的百分比較假手術(shù)組的下降。 4.Caspase—3、TUNEL免疫熒光染色及HE染色檢測結(jié)果 假手術(shù)組C

5、aspase—3(+)百分比為1.74％、TUNEL(+)細(xì)胞百分比為2.37％，脹亡細(xì)胞的百分比0.59％，模型組的分別為16.36％、20.26％和16.27％，兩組間比較差別有顯著性(P<0.05)。與各組相應(yīng)的Caspase—3(+)細(xì)胞比較，TUNEL(+)細(xì)胞的百分比明顯較高，兩者比較差別有顯著性。說明TUNEL(+)細(xì)胞的百分比遠(yuǎn)高于Caspase—3(+)細(xì)胞的百分比。 從組織切片上可以看到，一部分TUNEL(+

6、)細(xì)胞Caspase—3染色為陰性，對(duì)應(yīng)的HE片子上顯示此細(xì)胞為脹亡細(xì)胞。 結(jié)論： 1.肝臟細(xì)胞脹亡是HIRI重要的細(xì)胞死亡方式。 2.在HIRI中如果以TUNEL法作為評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的指標(biāo)，則導(dǎo)致過度評(píng)價(jià)。 第二部分附子多糖保護(hù)HIRI大鼠肝臟的量效、時(shí)效關(guān)系研究 材料與方法： 1.動(dòng)物分組 1.1附子多糖抗大鼠HIRI作用的量效關(guān)系研究實(shí)驗(yàn) 1.2.附子多糖抗大鼠HIRI

7、作用的時(shí)效關(guān)系研究實(shí)驗(yàn) 1.3方法 動(dòng)物模型的制作及假手術(shù)組處理如第一部分所述，各組SD大鼠肝缺血再灌注損傷模型的制作后，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測、膽堿脂酶(CHE)和白蛋白(ALB)。放血處死動(dòng)物，開腹取肝臟組織，行HE染色觀察組織標(biāo)本肝組織損傷程度評(píng)分。 結(jié)果： 1.附子多糖抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷作用的量效關(guān)系比較 1.1肝功

8、能變化結(jié)果比較 1.2肝臟貯備功能變化比較 1.3肝組織損傷程度病理評(píng)分比較 2.附子多糖抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷作用的時(shí)效關(guān)系比較 2.1肝功能結(jié)果比較 2.2肝臟貯備功能變化比較 2.3肝組織損傷程度病理評(píng)分比較 結(jié)論： 1.附子多糖在不同劑量(80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg連續(xù)5天灌胃)、不同使用時(shí)間(160mg/kg連續(xù)3天、5天、7天灌胃)上對(duì)

9、肝臟缺血再灌注損傷均有相應(yīng)程度的保護(hù)作用。 2.連續(xù)5天以160mg/kg劑量的附子多糖灌胃用以保護(hù)HIRI有最佳的時(shí)間和劑量效應(yīng)。 第三部分附子多糖抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制研究 材料與方法： 1.動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)過程 實(shí)驗(yàn)分為三組：假手術(shù)組，模型組，模型+FPS組(160mg/kg，5d)。模型的復(fù)制和藥物的使用同第一部分及第二部分。實(shí)驗(yàn)具體操作方法同第一部分及第二部分。 2.氧化應(yīng)

10、激指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取肝臟組織，測定組織中的SOD活性，MDA含量，總抗氧化能力(T—AOC)，CAT活性，GR活性； 3.線粒體指標(biāo)檢測 取肝臟組織進(jìn)行電子顯微鏡檢測并進(jìn)行線粒體體視學(xué)測量。取肝臟組織檢測線粒體呼吸控制率、Na+—K+—ATP酶活性、Ca2+—ATP酶活性。 4.肝臟細(xì)胞凋亡、脹亡檢測 同第一部分。 結(jié)果： 1.氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果 與假手術(shù)組(27.

11、13U/gprot)比較，模型組(45.68U/gprot)和模型+FPS組(37.72U/gprot)的MDA均升高，但模型+FPS組升高幅度較模型組的低，三組間比較差別有顯著性(P<0.05)。與假手術(shù)組(SOD、CAT、GR、T—AOC值分別為151.34 U/gprot、76.47 U/gprot、7.42 U/gprot、1.34 U/gprot)比較，模型組(SOD、CAT、GR、T—AOC值分別為80.74 U/gprot

12、、47.82U/gprot、6.45 U/gprot、0.56 U/gprot)和模型+FPS組(SOD、CAT、GR、T—AOC值分別為134.17 U/gprot、55.55 U/gprot、6.82U/gprot、1.06 U/gprot)的SOD、CAT、GR、T—AOC值均降低，但模型+FPS組降低幅度較模型組的低，三組間比較差別有顯著性(P<0.05)。說明附子多糖預(yù)防用藥后，HIRI大鼠肝臟組織氧化性物質(zhì)含量下降，還原性物

13、質(zhì)增多。 2.線粒體指標(biāo)檢測結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝臟細(xì)胞線粒體的平均粒子數(shù)、平均周長、平均面積均較高(P<0.05)；與模型組大鼠肝臟細(xì)胞線粒體的平均粒子數(shù)、平均周長、平均面積比較，模型+FPS組的均較小(P<0.05)。三組大鼠肝臟細(xì)胞線粒體的面積密度、粒子數(shù)密度、比表面的比較情況同二維體視學(xué)參數(shù)(P<0.05)，體積密度三組間比較差別無顯著性(P>0.05)。說明附子多糖預(yù)防用藥后，HIRI大鼠線粒體腫脹

14、程度下降，線粒體變形程度減輕。 模型組大鼠肝臟細(xì)胞線粒體的呼吸控制率、Na+—K+—ATP酶活性、Ca2+—ATP酶活性分別為3.01％、0.72μ molPi/mgprot/h、0.67μ molPi/mgprot/h明顯較假手術(shù)組(0.79％、1.48μ molPi/mgprot/h、1.13μ molPi/mgprot/h)的降低，而模型+FPS組大鼠肝臟細(xì)胞線粒體的呼吸控制率、Na+—K+—ATP酶活性、Ca2+—ATP

15、酶活性(5.31％、1.46μmolPi/mgprot/h、0.91μ molPi/mgprot/h)明顯較模型組的增高，差別有顯著性(P<0.05)。 3.流式細(xì)胞儀檢測 假手術(shù)組凋亡細(xì)胞和脹亡細(xì)胞的百分比分別為0.65％和0.15％，模型組的分別為14.99％和24.55％，模型+FPS組的分別為2.39％和19.48％。與假手術(shù)組比較，模型組和模型+FPS組的脹亡細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的百分比均升高，但模型+FPS組升高幅

16、度較模型組的低，三組間比較差別有顯著性(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組和模型+FPS組的正常細(xì)胞的百分比均降低，但模型+FPS組降低幅度較模型組的小，三組間比較差別有顯著性(P<0.05)。 4.免疫熒光染色檢測結(jié)果 假手術(shù)組凋亡細(xì)胞和脹亡細(xì)胞的百分比分別為1.74％和0.59％，模型組的分別為16.36％和16.47％，模型+FPS組的分別為9.95％和8.07％。與假手術(shù)組比較，模型組和模型+FPS組的凋亡細(xì)

17、胞和脹亡細(xì)胞的百分比均升高，但模型+FPS組升高幅度較模型組的小，三組間比較差別有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論： 1.HIRI大鼠肝臟組織存在還原性酶的減少和氧化性物質(zhì)的增多、肝臟細(xì)胞線粒體形態(tài)和功能受損、肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡和脹亡的現(xiàn)象。 2.預(yù)防性使用附子多糖是通過抑制HIRI大鼠氧化應(yīng)激作用、減輕線粒體形態(tài)和功能損害、減少肝臟細(xì)胞凋亡、脹亡發(fā)生的百分比而產(chǎn)生保護(hù)作用。 創(chuàng)新點(diǎn)： 1.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)