PAMAM介導(dǎo)pCTGF-shRNA抑制小鼠腹膜纖維化的實驗研究.pdf

1、持續(xù)性非臥床腹膜透析(CAPD)是終末期腎病(ESRD)患者的主要替代治療之一。研究顯示，透析相關(guān)性腹膜纖維化導(dǎo)致的超濾衰竭(UFF)已經(jīng)逐漸成為CAPD患者退出的主要原因，極大地限制了腹膜透析的推廣應(yīng)用。研究腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制和防治手段已成為維持腹膜透析持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。 腹膜纖維化是一個多細(xì)胞因子參與的病理生理過程，目前研究認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)在腹膜纖維化過程中為啟動和中樞作用，但由于其靶細(xì)胞種類繁多、效應(yīng)復(fù)雜，

2、完全阻斷后果難以預(yù)料。而結(jié)締組織生長因子(CTGF)作為TGF-β的下游因子，介導(dǎo)了TGF-β部分的促纖維化效應(yīng)，且作用單一，被認(rèn)為是可能比TGF-β更理想的抗腹膜纖維化的靶目標(biāo)。我們前期的研究已經(jīng)證實，以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的CTGF短發(fā)卡RNA(shRNA)，可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)CTGF、血管內(nèi)皮生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，對于腹膜纖維化具有潛在治療價值。但目前仍缺少以CTGF為靶點的、將RNA干擾(RNAi)

3、運(yùn)用于腹膜纖維化動物模型的研究，同時逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也存在隨機(jī)插入宿主序列的安全隱患。因此，在進(jìn)一步尋找更有效的基因治療方法來抑制腹膜細(xì)胞CTGF的表達(dá)。 近年來，聚酰胺-胺型樹枝狀高聚物(PAMAM dendrimers)作為核酸、質(zhì)粒的運(yùn)載體系逐漸得到重視。PAMAM是一種非病毒納米載體，具備無免疫原性、無遺傳毒性、轉(zhuǎn)染效率高、可長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)良特性，在DNA疫苗和基因治療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但目前尚未見PAMAM攜帶s

4、hRNA抑制促纖維化因子的研究報道。因此構(gòu)建了一種表達(dá)CTGF-shRNA的質(zhì)粒，通過PAMAM的介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠腹膜間皮細(xì)胞和小鼠腹膜纖維化模型，觀察其對腹膜間皮細(xì)胞和腹膜組織CTGF表達(dá)以及纖維化的影響。 本文分為三部分，第一章構(gòu)建表達(dá)CTGF-shRNA的pGenesil-1質(zhì)粒，第二章應(yīng)用PAMAM載體介導(dǎo)pCTGF-shRNA干擾原代培養(yǎng)的小鼠腹膜間皮細(xì)胞，第三章應(yīng)用PAMAM載體介導(dǎo)pCTGF-shRNA干擾

5、小鼠腹膜纖維化模型。 目的：構(gòu)建表達(dá)小鼠CTGF-shRNA的pGenesil-1質(zhì)粒(pCTGF-shRNA)，通過PAMAM納米載體介導(dǎo)，分別轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細(xì)胞和小鼠腹膜纖維化模型，研究其對于腹膜間皮細(xì)胞和腹膜組織的CTGF、TGF-β1及FN表達(dá)的影響。 方法： 1．應(yīng)用生物信息學(xué)方法，參考shRNA的設(shè)計策略，設(shè)計2條靶序列mCTGFl和mCTGF2以及一條陰性對照HK。分別與pGenesil-1質(zhì)粒連

6、接，構(gòu)建相應(yīng)的3個質(zhì)粒pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA和pHK-shRNA，并通過酶切和測序等方法進(jìn)行鑒定。檢測PAMAM G9/DNA(質(zhì)粒)復(fù)合物的物化特性。 2．采用胰蛋白酶消化法從小鼠腹膜組織中分離腹膜間皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，應(yīng)用PAMAM G9將pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA和pHK-shRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染高糖(4.25％葡萄糖)刺激下的第3代小鼠腹膜間皮細(xì)胞。采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒?/p>

7、應(yīng)(RT-PCR)半定量分析檢測細(xì)胞CTGF、TGF-β1和FN基因的轉(zhuǎn)錄水平，采用Western Blot檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。 3．將昆明小鼠隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組和對照組，分別經(jīng)腹腔注射PAMAM G9/pHK-shRNA復(fù)合物或生理鹽水，于24h、48h、96h和7d留取壁層和臟層腹膜組織，制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察壁層腹膜綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，同時采用Western Blot檢測臟層腹膜綠色熒光蛋白的表達(dá)。

8、 4．將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為CTGF干擾組、HK轉(zhuǎn)染組、腹膜纖維化模型組和正常對照組4組，分別給予相應(yīng)處理28天后，留取壁層和臟層腹膜組織。應(yīng)用Masson染色檢測壁層腹膜厚度，采用RT-PCR半定量分析檢測各組腹膜組織CTGF、TGF-β1和FN基因的轉(zhuǎn)錄水平，采用Western Blot和免疫組化檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。 結(jié)論： 1．PAMAM載體可介導(dǎo)pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA轉(zhuǎn)染原