內(nèi)含HIV-1gag編碼mRNA的MS2病毒樣顆粒構(gòu)建及體外表達(dá)和體內(nèi)免疫應(yīng)答研究.pdf

1、研究背景：
　　 RNA不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組,也不會(huì)引起自身免疫病或者產(chǎn)生抗DNA抗體等嚴(yán)重的副作用。從安全性角度考慮,基于mRNA的基因疫苗要優(yōu)于基于DNA的疫苗。但是mmNA容易降解、穩(wěn)定性差,且體內(nèi)轉(zhuǎn)移效率低,這無疑限制了mRNA的使用。MS2病毒樣顆粒穩(wěn)定性高,能夠保護(hù)裝載的外源mRNA,展示了其作為RNA疫苗新型遞送載體的潛在應(yīng)用價(jià)值。然而,真核系統(tǒng)表達(dá)的MS2病毒樣顆粒(VLPs)能否在動(dòng)物水平有效地誘導(dǎo)抗原特異

2、性免疫應(yīng)答,在國內(nèi)和國際上還沒有報(bào)道。
　　 研究目的：
　　 本研究通過釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得裝載HIV-1 gag編碼mRNA的MS2VLPs。從體外細(xì)胞水平驗(yàn)證MS2 VLPs包裝的mRNA能否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能,并通過體內(nèi)免疫動(dòng)物驗(yàn)證MS2 VLPs能否誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答。
　　 方法：
　　 1.單質(zhì)粒雙表達(dá)重組載體的構(gòu)建:將編碼衣殼蛋白的cDNA序列插入pESC-Ura載體,構(gòu)建

3、衣殼蛋白載體pMS。將編碼HIV-1 GAG蛋白的cDNA序列插入pMS構(gòu)建能包裝HIV-1 Gag mRNA的pMS-GAG VLPs的表達(dá)載體。構(gòu)建能包裝MS2衣殼蛋白自身編碼mRNA的pMS2C VLPs的表達(dá)載體作為對(duì)照。
　　 2.VLPs的表達(dá):上述構(gòu)建好的pMS—GAG載體和pMS2C載體經(jīng)測(cè)序鑒定正確后,轉(zhuǎn)化到釀酒酵母YPH499細(xì)胞內(nèi)。挑取陽性單克隆細(xì)胞在SD培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),然后SG培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)MS2病毒樣

4、顆粒。
　　 3.VLPs的純化:超聲波碎酵母后獲得含有HIV-1 gag mRNA的重組MS2病毒樣顆粒。在上清中加入DNaseⅠ和RNase A,37℃過夜消化,然后分子篩色譜層析純化VLPs。
　　 4.VLPs的驗(yàn)證:采用瓊脂糖凝膠電泳、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及電子顯微鏡鑒定。對(duì)上述純化后的VLPs進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,以驗(yàn)證VLPs是否包裝了全長的HIV-1 gag RNA。

5、>　　 5.pMS-GAG VLPs穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和耐酶性實(shí)驗(yàn)。
　　 6.VLPs包裝HIM-1 gag RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的表達(dá):提取pMS-GAG VLPs包裝的RNA,使用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞。24 h后,收集細(xì)胞,破碎后使用Genescreen Plus HIV Ag-Ab Elisa檢測(cè)試劑盒檢測(cè)gag蛋白的表達(dá)。
　　 7.MS2 VLPs免疫小鼠:取15μg純化的pMS-GAG VLPs

6、(5×1012 RNA拷貝)混合完全弗氏佐劑(佐劑和抗原體積比為1:1)制備成”油包水”乳狀液,免疫6-8周BALB/c小鼠。第3周和第5周使用同樣的VLPs混合不完全弗氏佐劑,加強(qiáng)免疫兩次。以15μg純化的pMS2C VLPs作為對(duì)照。最后一次免疫后1周,取小鼠尾靜脈血檢測(cè)抗原特異性抗體的產(chǎn)生。
　　 結(jié)果
　　 利用單質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng),在釀酒酵母YPH499細(xì)胞內(nèi)MS2衣殼蛋白成功的包裝了HIV-1 gag mRNA,形

7、成了MS2 VLPs。DNase和RNase消化結(jié)果表明,此病毒樣顆粒具有很好的耐DNase和RNase的特性。提取RNA轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(293T細(xì)胞、CHO細(xì)胞)后可檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。我們還進(jìn)一步證實(shí)了純化后的pMS-GAG VLPs免疫BALB/c(H-2d)小鼠后可以誘導(dǎo)抗原特異性體液免疫應(yīng)答。
　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用傳統(tǒng)分子克隆程序,成功構(gòu)建MS2病毒樣顆粒的釀酒酵母表達(dá)載體pMS-GAG。經(jīng)瓊脂糖凝

8、膠電泳、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及電子顯微鏡等檢測(cè)的方法證實(shí)釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可成功地表達(dá)MS2 VLPs。
　　 2.通過釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的MS2病毒樣顆粒能夠保護(hù)包裝的RNA不被降解,而且穩(wěn)定性好,可在4℃儲(chǔ)存四個(gè)月以上。MS2病毒樣顆粒具有無潛在生物傳染危險(xiǎn)性、易生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用方便的優(yōu)點(diǎn)。這些特性使得MS2 VLPs滿足RNA遞送載體的要求。
　　 3.通過釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的