裝載不同功能RNA的重組MS2病毒樣顆粒的原核表達及應(yīng)用研究.pdf

1、2014年西非爆發(fā)的埃博拉出血熱疫情在全世界范圍引起廣泛關(guān)注。中國與西非往來密切，疫情爆發(fā)期間，埃博拉病患自境外輸入中國的風險較高且持續(xù)存在。提高該病毒的早期準確檢測能力，成為我國防控埃博拉疫情的關(guān)鍵。
　　為提高全國范圍，特別是重要港口城市，具備埃博拉病毒檢測資質(zhì)的實驗室、檢驗檢疫機構(gòu)等對該病毒的檢測能力，2014年12月衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織開展相關(guān)質(zhì)量評價工作。鑒于埃博拉病毒屬于生物安全四級防控病毒，一旦感染具有極高的致死性

2、，常規(guī)利用滅活病毒或感染病人陽性血清制備質(zhì)控品的方法不適用于本次質(zhì)量評價。因此，我們選擇生物安全性高、穩(wěn)定性好、對RNA保護作用強的噬菌體MS2病毒樣顆粒（Bacteriophage MS2 virus-like particles，MS2 VLPs），制備包裹2014年西非流行株扎伊爾型埃博拉病毒核衣殼蛋白(Nucleoprotein，NP)RNA全長、包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）及RNA依賴的RNA聚合酶L(Poly

3、merase)部分RNA序列的重組MS2 VLPs質(zhì)控品，對各參評機構(gòu)進行發(fā)放。
　　在19家參評機構(gòu)回報的20份結(jié)果中（其中一家機構(gòu)回報了NP及GP/L雙靶標檢測結(jié)果），14家機構(gòu)(73.68％)回報完全正確，3家機構(gòu)(15.79％)出現(xiàn)一個假陰性結(jié)果，1家(5.26％)出現(xiàn)兩個假陰性結(jié)果，剩余1家機構(gòu)(5.26％)回報錯誤結(jié)果超過3個。本次質(zhì)評樣本盤中全部陰性樣本結(jié)果回報正確，上述錯誤回報結(jié)果主要集中在對弱陽性樣本的檢出方面。

4、針對本次質(zhì)量評價中存在的假陰性問題，我們提出使用商品化試劑盒或國家CDC提供的標準引物、探針檢測，使用雙靶標檢測方法，以及對操作人員規(guī)范化培訓、及時校準儀器等改進意見。本次質(zhì)評工作促進了各參評機構(gòu)埃博拉病毒核酸檢測能力的提高，在疫情爆發(fā)階段有效防控了埃博拉病毒流入中國。
　　在第二部分中，為解決之前基于MS2 VLP的miRNA遞送體系中，化學交聯(lián)方法存在的成功率低、成本高、周期長、步驟繁瑣等問題，我們采用噬菌體表面展示技術(shù)，制備

5、了表面展示細胞穿透肽TAT內(nèi)含pre-miR122的重組MS2 VLPs用于肝癌治療研究。
　　我們首先明確上述展示TAT的VLPs是否具備細胞膜穿透功能及遞送miR122的能力。為進一步檢測內(nèi)含pre-miR122表面展示TAT的MS2 VLPs對肝細胞癌的抑制效果，我們同時制備了內(nèi)含pre-miR122表面化學交聯(lián)TAT的MS2 VLPs做為對比。通過CCK8、transwell小室、流式細胞術(shù)、Western blot及CT

6、影像學分析、HE染色、免疫組化等方法，在細胞及動物水平明確上述兩種VLPs對肝癌的抑制效果及是否存在差異。
　　結(jié)果證明，內(nèi)含pre-miR122表面展示TAT的MS2 VLPs可成功穿透細胞膜，實現(xiàn)miR122的高效胞內(nèi)遞送。應(yīng)用表面展示TAT及化學交聯(lián)TAT的VLPs處理Hep3B、HepG2及Huh7三種肝癌細胞后可發(fā)現(xiàn)，上述兩種內(nèi)含pre-miR122的VLPs對三種細胞均存在抑制作用，且表面展示TAT的VLPs抑制效果更

7、加明顯。繼而我們選擇Hep3B細胞（VLPs處理后細胞水平腫瘤抑制效果最明顯）建立肝癌動物模型。對荷瘤組小鼠尾靜脈注射上述兩種VLPs后發(fā)現(xiàn)，表面展示TAT及化學交聯(lián)TAT內(nèi)含pre-miR122的VLPs均可有效抑制腫瘤生長，且以前者抑制效果更明顯。以上結(jié)果提示，我們制備的基于表面展示TAT的重組MS2 VLP miR122遞送載體具有細胞穿透功能，體內(nèi)、體外均對肝細胞癌具有抑制作用。與化學交聯(lián)TAT內(nèi)含pre-miR122的VLPs