ASFV、SVDV、FMDV-O、PRV的TEM-PCR檢測方法的初步研究.pdf

1、ASFV、SVDV、FMDV-O、PRV是豬病的4種重要病原。目前我國雖無ASF發(fā)生的報道，但是，由于鄰國俄羅斯多次報道該病的發(fā)生和其可能帶來的嚴(yán)重后果，能提早建立一種檢測方法對預(yù)防該病非常必要，且能為將來研究該病提供一定的試驗基礎(chǔ)。SVD、FMD在臨床表現(xiàn)上非常相似，很難從臨床癥狀將它們區(qū)別開來，所以能建立一種快速、準(zhǔn)確檢測和鑒別這兩種病的方法對將來的治療和預(yù)后意義重大。另外，在本實驗室的臨床調(diào)查中，PR一直是近幾年豬群當(dāng)中的高發(fā)病，

2、其惡劣的臨床表現(xiàn)嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。
　　本研究選定了4個靶基因片段，用pMD19-T克隆獲得了T/ASFV、T/FMDV-O、T/PRV、T/SVDV四個陽性重組質(zhì)粒。
　　在分析了ASFV、SVDV、FMDV-O、PRV致病因子基因的基礎(chǔ)上，依據(jù)靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)的原理，設(shè)計了4對特異性的套式PCR引物和探針，并在各內(nèi)引物的5'端分別加上能被一對通用引物識別的標(biāo)簽序

3、列。本試驗建立了一種能同步檢測4種常見病原的Tem-PCR方法。
　　優(yōu)化后的Tem-PCR方法Primer Mix的最佳濃度0.2μM，反應(yīng)的最佳退火溫度為50℃。實驗結(jié)果表明:ASFV、FMDV-O、PRV這3種病原，使用該方法可以在1支反應(yīng)管內(nèi)快速、同步進行檢測，得到大小分別為272bp(ASFV)，576bp(PRV)233bp(FMDV-O)的特異性產(chǎn)物。Tem-PCR方法對3種病原基因組的檢測靈敏度分別為:3.5×10

4、6 copies/μL(ASFV)、4.2×106 copies/μL（FMDV-O）、4.6×103 copies/μL(PRV)。特異性試驗發(fā)現(xiàn)該Tem-PCR方法從陽性重組質(zhì)粒T/ASFV、T/FMDV-O、T/PRV基因組中均得到了大量的特異性擴增產(chǎn)物，其他基因組DNA無特異性條帶出現(xiàn)。
　　用優(yōu)化的Tem-PCR方法擴增T/ASFV、T/FMDV-O、T/PRV、T/SVDV，并將產(chǎn)物用基因芯片技術(shù)檢測，結(jié)果所有的雜交質(zhì)