家蠶P450基因CYP9A19和CYP9A22的啟動(dòng)子分析.pdf

1、細(xì)胞色素P450酶系是一種廣泛存在于植物、動(dòng)物、細(xì)菌和真菌體內(nèi)的一種解毒酶系，對(duì)藥物、致癌物、除草劑、殺蟲(chóng)劑及其它環(huán)境有毒物質(zhì)的代謝過(guò)程中起到重要作用。家蠶既是鱗翅目昆蟲(chóng)研究的模式生物，又是支撐蠶絲產(chǎn)業(yè)的生物基礎(chǔ)，同時(shí)也是開(kāi)發(fā)生物反應(yīng)器和新型昆蟲(chóng)產(chǎn)業(yè)的材料。為深入了解家蠶細(xì)胞色素P450CYP9A19和CYP9A22兩個(gè)基因的誘導(dǎo)表達(dá)特征及其啟動(dòng)子活性開(kāi)展了研究，主要研究結(jié)果如下：
　　 采用雙跟蹤標(biāo)定定量PCR方法，檢測(cè)了家蠶

2、CYP9A19和CYP9A22基因在無(wú)誘導(dǎo)及氟化鈉誘導(dǎo)下各個(gè)組織中的基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：CYP9A19在中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管中均有較高水平的表達(dá)；CYP9A22在中腸、絲腺、馬氏管中有表達(dá)，但在脂肪體中無(wú)表達(dá)。氟化鈉誘導(dǎo)后隨時(shí)間變化的表達(dá)模式具有組織特異性，存在中腸、脂肪體先上調(diào)再恢復(fù)的正向誘導(dǎo)和馬氏管先下調(diào)再恢復(fù)的反向誘導(dǎo)兩種相反的誘導(dǎo)方向。結(jié)果說(shuō)明：在家蠶P450基因中CYP9A19和CYP9A22與氟化物抗性的相關(guān)性密切

3、。
　　 同時(shí)在細(xì)胞水平上，利用RNA干擾手段通過(guò)轉(zhuǎn)染不同干擾位點(diǎn)片段的方法篩選出干擾效果顯著的siRNA片段。結(jié)果表明：Bm-9A19-663和Bm-9A22-1384分別使BmN細(xì)胞CYP9A19，CYP9A22基因表達(dá)降低到對(duì)照的49.5g％和48.00%，這兩個(gè)位點(diǎn)分別對(duì)兩種基因干擾顯著。當(dāng)干涉CYP9A19時(shí)，CYP9A22基因的表達(dá)水平無(wú)明顯差異；當(dāng)干涉CYP9A22時(shí)，CYP9A19基因的表達(dá)水平卻顯著上調(diào)。說(shuō)明當(dāng)

4、CYP9A22基因表達(dá)明顯下調(diào)時(shí)，CYP9A19基因表達(dá)水平對(duì)其有一種補(bǔ)償效應(yīng)。
　　 家蠶CYP9A19和CYP9A22基因的過(guò)量表達(dá)與外源環(huán)境有毒物質(zhì)的代謝有關(guān)。為了研究該兩個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了功能分析，構(gòu)建了含熒光素酶報(bào)告基因和啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度順次缺失片段的重組質(zhì)粒，和內(nèi)參載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)后用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子活性。分析結(jié)果表明：家蠶CYP9A19基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)

5、錄起始位點(diǎn)上游-1492～-1102bp這一區(qū)域是重要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域；CYP9A22基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1630～-12lObp這一區(qū)域是重要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。0.1×10-2mol/L、0.1×10-3mol/L、0.1×104mol/L的NaF誘導(dǎo)細(xì)胞后，其中在0.1×10-3mol/L的NaF條件下，熒光素酶活性增強(qiáng)顯著，表明0.1×10-3mol/LNaF能上調(diào)基因的表達(dá)。表明受氟化鈉誘導(dǎo)家蠶后CYP9A19和CYP9A2

6、2基因的上調(diào)表達(dá)與其基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的升高有一定的關(guān)系。本研究為探索家蠶CYP9A19和CYP9A22基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)，但其具體功能和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在啟動(dòng)子活性方面研究應(yīng)用廣泛。我們就不同載體大小和構(gòu)建方法這兩個(gè)方面因素對(duì)雙熒光素酶系統(tǒng)的影響進(jìn)行深入研究討論。結(jié)果表明，載體越大，轉(zhuǎn)染效率越低，并得到了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，提出了消除轉(zhuǎn)染效率差異誤差的標(biāo)準(zhǔn)化方法。另一方面，研究CYP