肝癌細(xì)胞對TRAIL固有耐藥和獲得性耐藥的分子機(jī)制研究.pdf

1、肝癌是世界上最常見并且致死率最高的腫瘤之一。目前針對肝癌的治療方法有手術(shù)切除、放療和化療等，但是這些治療方法療效有限，因此迫切需要開發(fā)新型的抗肝癌藥物。TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand，人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)對多種對傳統(tǒng)療法耐受的腫瘤展現(xiàn)出潛在抑制作用，并且副作用小。TRAIL與其特異性受體DR4和DR5結(jié)合后誘導(dǎo)受體寡聚化同時(shí)促進(jìn)死亡誘導(dǎo)復(fù)合體的形成，進(jìn)而激活起始半胱天冬

2、酶Caspase-8。在I類細(xì)胞中，凋亡受體激活Caspase-8后產(chǎn)生足夠強(qiáng)的信號(hào)刺激Caspase-3活化進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。相反，在II類細(xì)胞中，Caspase-8活化不足以直接激活Caspase-3。活化的Caspase-8通過切割Bid蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)Bax蛋白活化，增加線粒體膜的通透性。促凋亡蛋白如cytochrome c、Smac和DIABLO等從線粒體內(nèi)釋放出來后進(jìn)而激活Caspase-9和Caspase-3。一些針對TRAI

3、L及其受體的新型藥物已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，但是腫瘤細(xì)胞對TRAIL的耐藥性阻礙了這些藥劑成為真正的抗腫瘤藥物。盡管一些腫瘤細(xì)胞對TRAIL展現(xiàn)出敏感性，但是在TRAIL長期處理后顯示出耐藥性（獲得性耐藥）。因此，研究腫瘤細(xì)胞對TRAIL的先天和獲得性耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞耐藥起關(guān)鍵作用的分子并對其進(jìn)行干預(yù)，對提高TRAIL對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用具有重要意義。
　　干擾素通過調(diào)節(jié)下游ISGs（IFN-stimulated genes，

4、干擾素刺激基因）表達(dá)來行使其生物學(xué)功能，研究表明干擾素通路紊亂會(huì)誘導(dǎo)ISGs過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和腫瘤耐藥。干擾素通過刺激細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL或Fas等凋亡配體，進(jìn)而激活下游外部或內(nèi)部線粒體依賴的凋亡通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在干擾素誘導(dǎo)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡過程中，參與破壞線粒體膜通透性促進(jìn)細(xì)胞色素釋放的多種蛋白被仍是未知的。干擾素調(diào)控的一些功能尚未完全明確的一些小分子蛋白包括ISG12a（The interferon alpha-inducib

5、le protein27，IFI27）、G1P3、IFITM3、IFITM2等。盡管ISG12a的表達(dá)調(diào)控已有一些研究，但是關(guān)于其生物學(xué)功能的研究還不多。目前一些研究結(jié)果表明ISG12a定位于線粒體上，對藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有調(diào)控作用，但是其在肝細(xì)胞中的表達(dá)情況報(bào)道較少，且目前尚無關(guān)于其調(diào)控TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)報(bào)道。在本論文中，我們以ISG12a為研究對象，檢測其在肝臟組織及多種肝癌細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)情況，并探討其在TRAIL誘導(dǎo)肝癌

6、細(xì)胞凋亡過程中的作用。
　　為了研究肝癌細(xì)胞對TRAIL的固有耐藥機(jī)制，我們以TRAIL處理不同的肝癌細(xì)胞系后，利用western blot、流式細(xì)胞術(shù)、DNA瓊脂糖電泳等方式檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示Huh7和HLCZ01細(xì)胞對TRAIL耐藥，LH86和HLCZ02細(xì)胞對TRAIL敏感。我們的研究結(jié)果表明TRAIL通過刺激cytochrome c的釋放并激活caspase-9誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，流式分析結(jié)果表明caspase廣譜抑制劑

7、Z-VAD-FMK可抑制TRAIL誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)干擾素刺激基因ISG12a在敏感細(xì)胞中表達(dá)高于耐藥細(xì)胞。在耐藥細(xì)胞中過表達(dá)ISG12a可增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，相反，在敏感細(xì)胞中沉默ISG12a則抑制TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證ISG12a在體內(nèi)介導(dǎo)TRAIL誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，我們將過表達(dá)ISG12a的Huh7細(xì)胞和沉默ISG12a的LH86細(xì)胞注射入免疫缺陷鼠皮下成瘤，然后通

8、過尾靜脈給小鼠注射TRAIL，觀察腫瘤體積變化。結(jié)果表明過表達(dá)ISG12a的Huh7細(xì)胞TRAIL處理后成瘤體積小于對照細(xì)胞，沉默ISG12a的LH86細(xì)胞TRAIL處理后腫瘤體積則大于對照細(xì)胞。通過TargetScan預(yù)測分析，ISG12a可能是miR-942的靶基因。通過雙熒光素酶報(bào)告和western blot實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)miR-942通過調(diào)控ISG12a3’UTR抑制其蛋白表達(dá)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)miR-942與ISG12a在腫瘤細(xì)

9、胞系和腫瘤組織中存在負(fù)相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Akt通過促進(jìn)miR-942表達(dá)，抑制ISG12a的表達(dá)，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性。
　　為了研究肝癌細(xì)胞對TRAIL的獲得性耐藥機(jī)制，我們利用對TRAIL敏感的LH86細(xì)胞進(jìn)行長期TRAIL處理，篩選得到耐藥株細(xì)胞，命名為LH86-TR。我們發(fā)現(xiàn)Akt活性在耐藥株細(xì)胞中降低，利用Akt特異性抑制劑無法逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性，表明Akt對LH86對TRAIL的獲得性耐藥沒有影響。通