誘導性多能干細胞和遠期短期腦缺血預適應對動脈損傷的治療作用及其機制.pdf

1、目前，來源于體細胞的誘導性多功能干細胞(iPS)細胞類似于胚胎干細胞，可以表達多功能性的標志物且在體內(nèi)外都具有分化為三個胚層細胞的潛能，但胚胎干細胞應用于人體存在倫理學和免疫排異問題，而iPS細胞不存在倫理學問題又具備胚胎干細胞的生物特性，同時從患者自身的細胞制備而來，所以具有廣泛的應用前景。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，介導iPS細胞與血管內(nèi)皮細胞粘附的整合素β亞基主要是整合素β1。文獻提示，microRNA-217在細胞運動、血管內(nèi)皮祖細胞分化

2、和血管新生中起重要作用。
　　因此我們以小鼠股動脈內(nèi)膜損傷為模型，研究iPS細胞在血管內(nèi)膜損傷中的作用及其機制。
　　第一部分:在成功制備出誘導性多能干細胞的前提下進行體內(nèi)研究。C57BL/6J8-10周齡雄性小鼠，每組動物都復制標準金屬絲擦傷股動脈內(nèi)膜損傷模型，然后分別于術(shù)后當天和術(shù)后第三天從尾靜脈注射PBS、MEF（胚胎成纖維細胞）、iPS，細胞劑量為6*104個/次/200μl，動物的觀察周期為3周，為了明確iPS細胞

3、進入動物體內(nèi)后的去向，我們采用術(shù)后從小鼠尾靜脈注射帶紅色熒光染料PKH的iPS細胞，觀察24h后留取股動脈，共聚焦熒光顯微鏡觀察iPS細胞在血管處的著位點;通過各組血管HE染色情況評價3周后各組動物血管內(nèi)膜/中膜厚度的比值。結(jié)果顯示通過術(shù)后從小鼠尾靜脈注入帶紅色熒光染料PKH的iPS細胞，24h后于共聚焦熒光顯微鏡下觀察，證實iPS細胞僅著位于損傷的血管內(nèi)膜處;同時，各組動物血管切片經(jīng)HE染色后統(tǒng)計血管內(nèi)膜/中膜厚度的比值，發(fā)現(xiàn)注射iP

4、S細胞組血管內(nèi)膜/中膜厚度的比值明顯小于其他各組(p＜0.05)。所以，我們首次證實iPS細胞僅著位于損傷血管內(nèi)膜處并對其有一定的修復作用。
　　第二部分:在iPS細胞對損傷血管內(nèi)膜有一定修復作用的基礎上，探討整合素β1（Integrin beta-1）在iPS細胞對損傷血管內(nèi)膜修復中的作用。C57BL/6J8-10周齡雄性小鼠，每組動物都復制股動脈內(nèi)膜損傷模型，然后分別于術(shù)后當天和術(shù)后第三天從尾靜脈注射PBS、MEF、iPS、I

5、ntegrin beta-1 siRNAs-iPS，細胞劑量為6*104個/次/200μl，動物的觀察周期為3周。由于Integrin beta-1 siRNAs-iPS組動物于術(shù)后4-7天陸續(xù)死亡，我們對動物生存情況進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)該組動物存活率顯著低于其它組，形態(tài)學分析發(fā)現(xiàn)，Integrin beta-1 siRNAs-iPS在損傷的血管內(nèi)膜部位誘發(fā)血栓形成。為了避免血栓形成，我們將Integrin beta-1 siRNAs-iPS

6、的劑量降至iPS組的1/6，即1*104個/次/200μl，發(fā)現(xiàn)該劑量的Integrin beta-1siRNAs-iPS既無治療作用，也無副作用。TetO是在iPS制備時轉(zhuǎn)入的外源性基因，在接受iPS治療的動物體內(nèi)不存在，所以可作為iPS的標志基因，用熒光標記原位雜交(FISH)的方法對其進行體內(nèi)定位，我們發(fā)現(xiàn)iPS治療3周后，在損傷的血管內(nèi)膜可檢測到該基因，而其它組均未發(fā)現(xiàn)基因探針整合。在接受Integrinbeta-1 siRNA

7、s-iPS細胞組（6*104個/次/200μl）的小鼠損傷內(nèi)膜亦檢測到FISH陽性細胞。提示抑制整合素β1表達不能阻斷iPS定位于血管內(nèi)皮細胞被剝脫的血管內(nèi)膜，但可阻斷iPS的治療作用，誘導血栓在損傷血管內(nèi)形成，導致動物死亡。iPS細胞進入動物體內(nèi)后對損傷血管內(nèi)膜發(fā)揮修復作用依賴于Integrin beta-1。
　　第三部分:由于microRNA-217在細胞運動、血管內(nèi)皮祖細胞分化和血管新生中起重要作用，我們假設其可能對iPS

8、的遠動和對血管損傷的治療作用存在類似的影響。因此本部分研究探討microRNA-217在iPS細胞對損傷血管內(nèi)膜修復中作用。C57BL/6J8-10周齡雄性小鼠，每組動物都復制股動脈內(nèi)膜損傷模型，然后分別于術(shù)后當天和術(shù)后第三天從尾靜脈注射PBS、MEF、iPS、ControlsiRNA-iPS、microRNA217-iPS，細胞劑量為6*104個/次/200μl，動物的觀察周期為3周。各組動物血管經(jīng)HE形態(tài)學染色后統(tǒng)計血管內(nèi)膜/中膜厚

9、度的比值，發(fā)現(xiàn)注射iPS或ControlsiRNA-iPS細胞組的比值明顯小于其它組(p＜0.05)，提示microRNA217阻斷了iPS對血管損傷的治療作用。細胞熒光染色定位方法發(fā)現(xiàn)，注入動物體內(nèi)iPS或ControlsiRNA-iPS細胞3周后存在于損傷血管內(nèi)膜處，而在其它組的血管內(nèi)膜，包括microRNA217-iPS組，未見陽性細胞。提示miR-217在iPS治療血管損傷中起關鍵作用。miR-217的靶基因Sirt1，所以，推

10、測Sirt1對iPS發(fā)揮治療功能有重要影響。
　　目的:以大鼠實驗性左側(cè)大腦中動脈缺血性腦卒中(MCAO)為模型，研究腦短期缺血預適應(Ischemic preconditioning，IPC)在腦缺血再灌注損傷的遠期保護作用并探討HO-1和腺苷受體A1的作用。
　　方法:Wistar12周齡雄性大鼠，實驗組夾閉左側(cè)頸內(nèi)動脈20min做缺血預處理，對照組夾閉左側(cè)頸內(nèi)動脈2s。實驗組和對照組分別采用PBS、HO-1誘導劑Hem

11、in、HO-1抑制劑Znpp、腺苷A1受體拮抗劑DPCPX處理，各組動物3周后均進行MCAO術(shù)。采用神經(jīng)功能評分、腦組織梗死面積大?。═TC染色法）評價缺血預處理和HO-1的保護作用;用免疫組織化學法和Western blotting方法檢測HO-1及腺苷受體的表達情況。
　　結(jié)果:Longa神經(jīng)功能評分法表明，缺血預處理20min可明顯改善大鼠MCAO術(shù)后神經(jīng)功能損傷情況，腦梗死面積顯著縮小。Hemin可以促進缺血預處理的保護作

12、用。免疫組織化學及Western blotting結(jié)果顯示HO-1、腺苷受體A1和A2a在腦組織梗死邊緣區(qū)的表達量明顯高于梗死區(qū)。Western blotting結(jié)果顯示Znpp可使缺血預處理后HO-1的表達量在梗死區(qū)腦組織及邊緣區(qū)腦組織中反饋性地增加。
　　結(jié)論:首次發(fā)現(xiàn)短期腦缺血預適應對腦缺血再灌注損傷有遠期保護作用，至少可持續(xù)至3周;HO-1在腦缺血預適應的遠期保護作用中起重要作用;在對腦缺血再灌注損傷的保護作用中，HO-1