蜈蚣提取液的分離純化與治療肝細(xì)胞性肝癌機(jī)制的研究.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，死亡率在癌癥中占第三位，在亞洲和非洲平均每年100，000人中就有約50-150人死于HCC。近20年來，我國HCC的治療盡管取得了長足的進(jìn)步，早期診斷率、手術(shù)切除率、術(shù)后生存率及生存質(zhì)量均有較大提高，但HCC的發(fā)病率和死亡率仍占癌癥中的第二位。
　　 治療方法選擇主要取決于腫瘤的分期及肝功能情況。手術(shù)切除(包括部分肝切除和肝移

2、植)可能治愈小肝癌，而對(duì)進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移性HCC療效有限。對(duì)于不能手術(shù)切除或全身情況差不能耐受手術(shù)者，可采取腫瘤的局部和全身治療相結(jié)合的方法。盡管目前治療方法很多，但每種方法各有其局限性，對(duì)中、晚期HCC的療效有限。故尋找有效的治療藥物是提高中、晚期HCC存活率及改善生活質(zhì)量的重要手段，具有重要意義。
　　 在我國，蜈蚣用于疾病的預(yù)防和治療已有兩千余年的歷史。近年研究表明蜈蚣全蟲提取液有多種作用，其抗腫瘤的效果亦有少量報(bào)道。為此，我

3、們以肝癌細(xì)胞株Bel-7402為研究對(duì)象，采用分離純化的蜈蚣提取液產(chǎn)物處理細(xì)胞，通過觀察其對(duì)Bel-7402細(xì)胞的增殖及形態(tài)等的影響，進(jìn)一步了解蜈蚣提取液治療肝癌的效果并探討其作用機(jī)制，為蜈蚣提取液臨床治療肝癌提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一章、蜈蚣蛋白質(zhì)體外抗癌作用的研究
　　 目的：提取ECP總液并將其分離為上清液和蛋白質(zhì)，分別研究三者對(duì)肝癌細(xì)胞株Bel-7402增殖的抑制作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株Be

4、l-7402，分別采用不同濃度ECP總液、上清液及蛋白質(zhì)處理細(xì)胞，利用倒置光學(xué)顯微鏡觀察Bel-7402細(xì)胞的形態(tài)變化，并通過MTT法研究肝癌細(xì)胞Bel-7402對(duì)它們的敏感性。同時(shí)體外培養(yǎng)正常肝細(xì)胞株LO2，觀察不同濃度ECP總液處理后，LO2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及對(duì)ECP總液的敏感性。
　　 結(jié)果：
　　 ①光鏡下和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果示，ECP總液、ECP蛋白質(zhì)和5-Fu作用48小時(shí)后，Bel-7402細(xì)胞數(shù)量減少明顯，部分未壞

5、死細(xì)胞形態(tài)變圓變小，而ECP上清液作用Bel-7402細(xì)胞、ECP總液作用LO2細(xì)胞48小時(shí)后，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少不明顯。
　　 ②MTT法示，ECP總液、ECP蛋白質(zhì)和5-Fu對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制率分別為0.788、0.453、0.944，而ECP上清液對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制率為0.198，ECP總液對(duì)LO2細(xì)胞的抑制率為0.095。
　　 ③MTT法示ECP總液在12mg/ml、1.2mg/ml、0.1

6、2mg/ml、0.012mg/ml、0.0012mg/ml時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞株Bel-7402的抑制率分別為0.788、0.608、0.308、0.207、0.099，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為9.597mg/ml。ECP蛋白質(zhì)在2.9mg/ml、0.29mg/ml、0.029mg/ml、0.0029mg/ml、0.00029mg/ml時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞株Bel-7402的抑制率分別為0.453、0.208、0.145、0.077、0.063

7、，IC50為1.372mg/ml。
　　 ④細(xì)胞生長-抑制率曲線示對(duì)Bel-7402細(xì)胞抑制率，隨ECP總液和ECP蛋白質(zhì)的濃度的增加而依次提高，與Bel-7402陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 ⑤MTT法示ECP總液在12mg/ml、1.2mg/ml、0.12mg/ml、0.012mg/ml、0.0012mg/ml時(shí)，對(duì)肝細(xì)胞株LO2的抑制率分別為0.095、0.040、0.037、0.022、

8、0.005。
　　 結(jié)論：
　　 ①ECP總液中抑制肝癌細(xì)胞株Bel-7402生長的主要是ECP中的蛋白質(zhì)成分，ECP總液和ECP蛋白質(zhì)能抑制Bel-7402細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)；ECP上清液對(duì)肝癌細(xì)胞株Bel-7402的增殖沒有明顯影響。
　　 ②ECP總液對(duì)肝細(xì)胞株LO2的增殖沒有明顯影響。
　　 第二章、蜈蚣蛋白質(zhì)抗腫瘤活性成分的分離純化
　　 目的：逐層分離純化蜈蚣總蛋白質(zhì)

9、，觀察肝癌細(xì)胞株Bel-7402對(duì)所得產(chǎn)物的敏感性并進(jìn)行有效成分鑒定。
　　 方法：
　　 ①體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株Bel-7402，采用Bestarose Cross Link-6B(CL-6B)凝膠過濾、DEAE Sepharose FF離子交換層析、Sephadex G-75凝膠過濾對(duì)ECP蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化；將得到的產(chǎn)物分別以不同濃度干預(yù)Bel-7402細(xì)胞，采用MTT法進(jìn)行體外抑瘤活性檢測(cè)；
　　 ②利用倒

10、置光學(xué)顯微鏡，觀察經(jīng)不同濃度ECP蛋白質(zhì)的分離物處理后Bel-7402細(xì)胞形態(tài)的變化，以找出蜈蚣主要抗腫瘤活性蛋白質(zhì)；
　　 ③通過SDS-PAGE電泳對(duì)有效成分進(jìn)行分子量測(cè)定。
　　 結(jié)果：
　　 ①ECP蛋白質(zhì)經(jīng)過CL-6B凝膠過濾層析后，得到5種成分。光鏡下、細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法示，C、E液抑制Bel-7402細(xì)胞生長明顯，其所含蛋白質(zhì)分子量范圍分別在1.6×106～2.2×106、1×104～4×105。M

11、TT法和細(xì)胞生長-抑制率曲線圖示，對(duì)Bel-7402細(xì)胞抑制率隨C、E液的濃度的增加而依次提高。與Bel-7402陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 ②將C、E液合并通過DEAE Sepharose FF離子交換層析后，得到7種成分，光鏡下、細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法示G、I液抑制Bel-7402細(xì)胞生長明顯，其所含蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在6.8以下。MTT法和細(xì)胞生長-抑制率曲線圖示，對(duì)Bel-7402細(xì)胞抑制率隨G、I液的

12、濃度的增加而依次提高。與Bel-7402陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 ③將G、I液合并通過Sephadex G-75凝膠過濾層析后，得到4種成分，光鏡下、細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法示，O、P液抑制Bel-7402細(xì)胞生長明顯，其所含蛋白質(zhì)分子量范圍分別在4×104～6×104、2×104～4×104。MTT法和細(xì)胞生長-抑制率曲線圖示，對(duì)Bel-7402細(xì)胞抑制率隨O、P液的濃度的增加而依次提高。與Bel-74

13、02陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。O液的IC50為1.132mg/ml，P液的IC50為1.129 mg/ml。
　　 ④SDS-PAGE電泳結(jié)果示，O、P液含多種蛋白質(zhì)，其中O液包括7條含量較高的蛋白質(zhì)，其分子量分別在120kD(1 kD=103)，60 kD，48 kD，35 kD，33kD，25 kD，20 kD左右。P液中存在6條含量較高的蛋白質(zhì)，其分子量分別在120kD，80kD，35 kD，33kD

14、，25kD，20kD左右。
　　 ⑤光鏡下、細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法示不同濃度的A、B、D、H、J、K、L、M、N液對(duì)肝癌細(xì)胞株Bel-7402的生長抑制作用不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 ①經(jīng)CL-6B、DEAE FF、Sephadex G-75得到的抗腫瘤活性成分，兩者均為酸性蛋白質(zhì)混合物，其分子量范圍在2×104～6×104之間；
　　 ②O液和P液均能抑制Bel-7402細(xì)胞的增殖，其作用呈劑量依賴性，O

15、、P液體外抑瘤活性較ECP總液均提高了約8.5倍；
　　 第三章、ECP總液對(duì)肝癌細(xì)胞株Bel-7402的作用及機(jī)制的研究
　　 目的：研究ECP總液對(duì)肝癌細(xì)胞株Bel-7402中Galectin-7和p-JNK1表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。
　　 方法：以半數(shù)抑制濃度的ECP總液(10mg/ml)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株Bel-7402不同時(shí)間(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48h)，通過Weste

16、rn blot、Real time-PCR、免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) Galectin-7和p-JNK1的蛋白及mRNA表達(dá)；用Galectin-7-siRNA預(yù)處理Bel-7402細(xì)胞，再予10mg/ml ECP總液誘導(dǎo)48 h，觀察Galectin-7的蛋白及mRNA表達(dá)和p-JNK1的蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 ①Western blot、Real time-PCR、免疫熒光均顯示，ECP總液干預(yù)呈時(shí)間依賴性上調(diào)

17、肝癌細(xì)胞株Bel-7402中Galectin-7和p-JNK1的蛋白及mRNA，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 ②Western blot、Real time-PCR、免疫熒光均顯示，Galectin-7-siRNAs可顯著抑制ECP總液對(duì)Galectin-7的蛋白及mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用，與ECP總液刺激組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 ③Western blot顯示，Galecti

18、n-7-siRNAs可顯著抑制ECP總液對(duì)p-JNK1蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用，與ECP總液刺激組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：ECP總液呈時(shí)間依賴性上調(diào)肝癌細(xì)胞株Bel-7402中Galectin-7的蛋白及mRNA和p-JNK1的蛋白及mRNA，提示ECP總液可能通過Galectin-7-JNK途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞株Bel-7402的凋亡。