羧甲基裂褶多糖抗腫瘤作用的實驗研究.pdf

1、背景和目的： 隨著惡性腫瘤的發(fā)生率不斷上升，惡性腫瘤已成為急待人類攻克的重大課題。目前，對惡性腫瘤的治療，除手術、放療和化療三大治療手段外，以免疫治療為代表的腫瘤生物治療已成為重要的腫瘤輔助治療方法[1]。正常人的免疫系統(tǒng)能識別和殺死惡性腫瘤細胞，免疫防護能力差或對不正常細胞識別能力差，均能導致癌癥的發(fā)生率增高。因此，免疫刺激劑和免疫調節(jié)劑被認為是潛在的抗癌劑[2]。 多糖類就是一種重要的生物反應調節(jié)劑。多糖做為一種免疫

2、促進劑不僅能夠促進T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞的免疫功能。還能促進細胞因子的合成或提高免疫細胞對細胞因子的敏感性?？捎糜谥委煱┌Y，并無骨髓抑制等毒性[3]。植物多糖可通過對荷瘤機體的免疫調節(jié)作用達到抗腫瘤的效果已得到世界的公認。 裂褶菌胞外多糖(Schizophyllan，SPG)是由藥用真菌裂褶菌(SchizophyllumcommuneFries)深層發(fā)酵產生的一種中性的胞外多糖，具有β-(1-6)葡萄糖苷分支的β-(

3、1-3)-D葡聚糖結構，主鏈上每隔3個葡萄糖單元產生一個分支。它具有良好的抗腫瘤活性[5]。裂褶多糖(SPG)作為一種免疫功能調節(jié)劑，主要是通過增強機體的免疫功能以殺死或抑制腫瘤細胞。國內外對其免疫作用機制的研究有不少報道[6]。如在體外，10-100μg/mL劑量的SPG能提高刀豆素A誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖反應。拮抗免疫抑制劑氫化可的松對淋巴細胞的增殖反應，增加脾淋巴細胞抗羊紅細胞抗體的數(shù)量，并能增加遲發(fā)型皮膚過敏反應，提高細胞免疫

4、功能。對于實驗小鼠，裂褶多糖對S-180的腹水瘤和實體瘤、Lewis肺癌等表現(xiàn)出抑瘤活性[7-8]。 多糖的免疫活性受多方面因素的影響，包括溶解性、分子量、化學結構、給藥途徑和劑量、提取方法以及受藥動物種類等[9]。裂褶多糖已被證明具有良好的抗腫瘤、抗感染，提高免疫力等作用。但國內生產裂褶多糖產品存在著可溶性差，分子量大，效果不肯定等問題。為了提高多糖的免疫調節(jié)作用，對多糖進行改性可能會產生一些新的理化性質，有利于對構效關系的闡

5、述，增加其抗腫瘤療效，是目前多糖研究的熱點之一，現(xiàn)已應用多種改性方法，并取得大的進展[4]。羧甲基化作為一種常見的化學反應在淀粉、纖維素等高分子材料的改性中得到了廣泛的應用。近年的研究表明[10]，制備一定取代度的羧甲基化多糖往往能夠起到增強抗腫瘤活性的作用。 本研究首次將較大分子量的裂褶多糖結構進行羧甲基化的不同取代度的改性，使其分子量較小，水溶性好，黏度低，易于制成各種劑型，給藥方便，并對其作用機制進行初步探討，希望通過改性

6、提高其抗腫瘤效果，為開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供理論依據。 方法： 1.制備羧甲基化裂褶多糖，使用凝膠過濾法測定其分子量。 2.用BLCB/C小鼠采用腹腔種植法建立肝癌模型，設立陰性對照組(NS)、陽性對照組(5-Fu)、裂褶多糖組(SPG)、兩種不同取代度的羧甲基裂褶多糖組(CM-SPG1、CM-SPG2)。以給藥后瘤體大小、瘤重、抑瘤率、組織病理學檢查等指標評價改性前后的裂褶多糖作用于荷瘤小鼠的效果。 3.

7、以鼠肝癌細胞株H22和人肺癌細胞株GLC-82為對象，設立陰性對照(NS)組、陽性對照組(DDP)、裂褶多糖組(SlaG)、兩種不同取代度的羧甲基裂褶多糖組(CM-SPG1、CM-SPG2)。依據臺盼藍拒染法和四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)操作，以細胞死亡率和OD值評價改性前后裂褶多糖對腫瘤細胞是否具有細胞毒作用。 4.肝癌荷瘤小鼠分成4組，設空白對照組(NS組)、陽性對照組(CY組)裂褶多糖組(SPG)和羧甲基化裂

8、褶多糖給藥組(CM-SPG1組)。處死前摘眼球取血分離上清，采用放射免疫法測量血清TNF-α、IL-2含量。操作按說明書進行。 5.統(tǒng)計學分析采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包處理，實際數(shù)據以均數(shù)±標準差(x±s)表示；(1)荷瘤小鼠不同藥物組的瘤重比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。組間兩兩比較采用LSD法(或SNK法)。p<0.05時認為存在顯著差異。(2)不同時間、不同藥物的OD值比較采用4×3析因方差分析(F

9、actorialanalysis)。p<0.05時認為存在顯著差異。(3)不同時間、不同藥物的細胞死亡率采用多組率之間的X2檢驗(Chi-SquareTest)。p<0.05時認為存在顯著差異。(4)不同組間血清含量測定采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。組間兩兩比較采用LSD法(或SNK法)。p<0.05時認為存在顯著差異。 結果： 1.羧甲基裂褶多糖分子量為1×105Da。 2.荷瘤小鼠實驗結果

10、 (1)小鼠瘤重各組瘤重有顯著性差異(p<0.05)；SPG組與CM-SPG1、CM-SPG2表現(xiàn)出顯著性差異(p(0.05)，改性前與改性后的兩種取代度裂褶多糖存在顯著性差異，改性后瘤重小于改性前瘤重，認為改性后抗腫瘤作用提高；CM-SPG1和CM-SPG2組無顯著性差異(p>0.05)，兩種不同取代度的羧甲基裂褶多糖的抑瘤作用無顯著性差異。 (2)各組抑制率從大到小依次為：5-Fu、CM-SPG1、CM-SPG2、SP

11、G。 (3)組織病理學各組腫瘤組織形態(tài)相似，均為低分化癌，并浸潤骨骼肌組織，都可見凝固性壞死。SPG組和CM_SPG-1組腫瘤細胞相對致密，5-Fu組腫瘤細胞相對疏松，染色淺；凝固性壞死區(qū)占比例5-Fu組最大，SPG組次之，CM-SPG-1組最小；凋亡細胞數(shù)目5-Fu組最多，CM-SPG-1組次之，SPG組最少；空泡狀細胞5-Fu組和CM-SPG-1組都較多，SPG最少；淋巴細胞等炎癥細胞浸潤結締組織見于SPG組和CM-SPG-

12、1組，5-Fu組不明顯。 3.CM-SPG體外作用于肝癌細胞株H22的臺盼藍拒染法所測得的細胞死亡率進行X2檢驗各組存在顯著性差異(p<0.05)。DDP組死亡率顯著高于各組。SPG、CM-SPG1、CM-SPG2、NS組死亡率無顯著差異(p>0.05)。認為改性前后的裂褶多糖在體外均末對肝癌細胞表現(xiàn)出抑制作用，無細胞毒作用。 4.CM-SPG體外作用于肺癌細胞株GLC-82的MTT所測的OD值進行析因分析，認為各給藥組

13、和DDP對照組有顯著性差異(p<0.05)。與生理鹽水給比較各給藥組之間無顯著性差異(p>0.05)，改性前和改性后裂褶多糖在體外對肺癌細胞無抑制作用，無細胞毒作用。 5.血清TNF-α、IL-2含量各組含量有顯著性差異(p<0.05)；SPG、CM-SPG1組含量顯著高于NS組及CY組，CY組顯著低于NS組。CM-SPG1組與SPG組含量存在顯著性差異(P<0.05)，CM-SPG1含量高于SPG組。改性后裂褶多糖較改性前免疫