能量可控陡脈沖對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、陡脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜的不可逆性擊穿導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的原理使其有可能成為惡性腫瘤低創(chuàng)或微創(chuàng)物理治療的新方式。本課題組在前期研究中已證實(shí)能量可控陡脈沖能有效的殺死腫瘤細(xì)胞，但在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)由于脈沖電場(chǎng)隨著距離的增加而減弱，因此在治療的腫瘤組織的周邊存在著殘留的腫瘤細(xì)胞。這些殘留的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為是否有變化，其侵襲轉(zhuǎn)移能力是否可能變化；這對(duì)于能否將能量可控陡脈沖安全地用于臨床具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究旨在用能量可控陡脈沖作用后的腫瘤細(xì)胞作為殘留

2、腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)研究殘留腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，尤其是其侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。 第一部分：能量可控陡脈沖對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 目的：觀(guān)察能量可控陡脈沖對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響；分析不同劑量的能量可控陡脈沖對(duì)SKOV3侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響及其相關(guān)性；尤其是亞致死劑量下SKOV3細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化。 方法：體外培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，將細(xì)胞分為七組；以假電擊組作為陰性對(duì)

3、照組，秋水仙堿處理組、5-氟尿嘧啶處理組、秋水仙堿和5-氟尿嘧啶聯(lián)合處理組作為陽(yáng)性對(duì)照組，用三種不同劑量的能量可控陡脈沖處理細(xì)胞。用機(jī)械法測(cè)定細(xì)胞粘附能力；用Transwell小室分別測(cè)定SKOV3細(xì)胞的體外侵襲、趨化運(yùn)動(dòng)能力。用倒置顯微鏡觀(guān)察Transwell小室背面的細(xì)胞數(shù)并分區(qū)計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)；取下小室的膜做蘇木素一伊紅(Haematoxylin and Eosin，HE)染色，在光鏡下計(jì)數(shù)小室背面的細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果：秋水仙堿和

4、5-氟尿嘧啶聯(lián)合處理組細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象完全消失，5-氟尿嘧啶處理組細(xì)胞的作侵襲、趨化運(yùn)動(dòng)而到達(dá)膜背面的數(shù)量未見(jiàn)明顯降低；秋水仙堿處理組及三種不同劑量的能量可控陡脈沖處理組的細(xì)胞侵襲、趨化運(yùn)動(dòng)而到達(dá)膜背面的的數(shù)量較陰性對(duì)照組有降低，差異有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論：能量可控陡脈沖能夠降低SKOV3細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力；其降低SKOV3細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力與其劑量有相關(guān)性。 第二部分：能量可控陡脈沖對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV

5、3細(xì)胞骨架作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討能量可控陡脈沖對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞骨架的影響。 方法：將SKOV3細(xì)胞分成5組，用不同參數(shù)處理，并用經(jīng)秋水仙堿處理的SKOV3細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組；以未經(jīng)處理的假電擊組作為陰性對(duì)照組。以羅丹明．鬼筆環(huán)肽直接標(biāo)記微絲，以免疫熒光法標(biāo)記微管，用共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察。制作電鏡標(biāo)本，用電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞骨架的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：免疫熒光圖像結(jié)果表明，能量可控陡脈沖作用的SKOV3細(xì)

6、胞喪失正常的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)；微絲明顯解聚、骨架蛋白彌散分布、細(xì)胞骨架的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失；微管解聚，偽足減少且其中的微絲明顯解聚，排列紊亂，結(jié)構(gòu)消失。而且這一作用與劑量呈正相關(guān)。 結(jié)論：能量可控陡脈沖對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞骨架有明顯的作用，可以使微絲和微管解聚，細(xì)胞的偽足減少，細(xì)胞骨架的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失。 第三部分：能量可控陡脈沖對(duì)卵巢癌基質(zhì)金屬蛋白酶9及其抑制物1蛋白表達(dá)的調(diào)控 目的：基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與金屬

7、蛋白酶組織抑制物(TIMPs)之間活性的平衡調(diào)節(jié)破壞是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的主要原因。研究表明高強(qiáng)度陡脈沖對(duì)腫瘤有殺傷和抑制作用，但是否能調(diào)控卵巢癌細(xì)胞MMPs及TiMPs蛋白的表達(dá)，目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀(guān)察能量可控陡脈沖對(duì)卵巢癌細(xì)胞MMPs及TIMPs蛋白的表達(dá)的影響。 方法：以卵巢癌裸鼠皮下移植瘤為模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，采用高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)，電壓1000V、頻率1000Hz、脈寬250ns于卵巢組織5min

8、，免疫熒光法檢測(cè)陡脈沖作用后卵巢癌細(xì)胞MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：對(duì)照組卵巢癌組織MMP-9及TIMP-1免疫熒光強(qiáng)度分別為140.21±5.16和74.98±3.14，兩者比例為1.87。陡脈沖作用于卵巢癌組織后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整，MMP-9顯著降低，熒光強(qiáng)度50.37±2.61，而。TIMP-1表達(dá)明顯增加，熒光強(qiáng)度116.40±4.70，比例倒置。與對(duì)照組比較，兩種蛋白表達(dá)差異均有顯著性(P<0.05)