γ—氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型Ⅰ(GAT1)基因剔除小鼠系的建立與表型分析.pdf

1、本研究分為三部分：第一部分、GAT1基因剔除與酒精的行為作用
　　 γ—氨基丁酸能系統(tǒng)(GABAergicsystem)參與調(diào)節(jié)多種酒精體內(nèi)作用的事實(shí)已經(jīng)被廣泛接受。在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型1(GABAtransportersubtype1，GAT1)通過其對(duì)GABA的高親和的重?cái)z取功能(reuptake)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞外(突觸間隙)神經(jīng)遞質(zhì)GABA的平衡濃度，從而對(duì)保持正常的GABAergic系統(tǒng)功能起著

2、非常重要的作用。本文中，我們利用傳統(tǒng)的同源重組方法獲得GAT1基因剔除小鼠，PCR和Southern-blot證明純合子小鼠的GAT1基因缺失，RT-PCR、Western-blot證實(shí)純合子小鼠腦中沒有GAT1基因的表達(dá)，體外突觸體重?cái)z取實(shí)驗(yàn)證實(shí)純合子小鼠的GABA重?cái)z取能力顯著下降；采用多種行為模型在GAT1基因缺失的雜合子和純合子小鼠上測(cè)試了酒精作用的變化。這些測(cè)試包括：酒精、糖精和奎寧溶液的飲用量和偏愛；酒精誘導(dǎo)的條件性位置偏好

3、(conditionedplacepreference，CPP)；酒精誘導(dǎo)的條件性味覺厭惡(conditionedtasteaversion，CTA)；酒精刺激的運(yùn)動(dòng)(活動(dòng))；酒精的鎮(zhèn)靜/催眠作用以及酒精的抗焦慮作用等。結(jié)果表明：與野生型小鼠相比，純合子小鼠表現(xiàn)出對(duì)酒精誘導(dǎo)的條件性厭惡和獎(jiǎng)賞(偏好)作用明顯降低，對(duì)酒精的運(yùn)動(dòng)刺激作用和鎮(zhèn)靜/催眠作用的敏感性明顯下降，但是增強(qiáng)了對(duì)奎寧溶液的回避(avoidance)此外，純合子小鼠在高架十

4、字迷宮(elevatedplusmaze，EPM)的測(cè)試中表現(xiàn)出抗焦慮樣(anxiolytic-like)行為，且酒精仍可以明顯地增加其在開放臂的探索時(shí)間。令人驚奇的是雜合子小鼠也表現(xiàn)出明顯的、甚至與純合子相反的表型：增加對(duì)酒精和糖精溶液的攝取和偏愛，同時(shí)又表現(xiàn)出對(duì)奎寧溶液的回避增強(qiáng)、對(duì)酒精誘導(dǎo)的CPP作用的增強(qiáng)、對(duì)酒精誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)作用更加敏感。這些結(jié)果首次清楚地表明GAT1對(duì)酒精的某些行為上的作用具有雙向調(diào)節(jié)的特性。因此，GAT1基因剔

5、除小鼠系的建立為進(jìn)一步研究酒精在生物體內(nèi)的作用機(jī)制提供了一個(gè)有價(jià)值的動(dòng)物模型。
　　 第二部分、GAT1基因剔除與痛覺的關(guān)系
　　 抗癲癇藥物tiagabine具有鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制在于其能專一性地阻斷GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型I(GAT1)的重?cái)z取，導(dǎo)致細(xì)胞外GABA平衡濃度上升并激活GABA的受體，從而增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。GAT1基因剔除小鼠(純合子和雜合子)可被視為終身使用GAT1抑制劑的動(dòng)物模型。本

6、文利用四種不同的疼痛模型：甩尾試驗(yàn)、熱板試驗(yàn)、扭體試驗(yàn)和福爾馬林注射試驗(yàn)來(lái)考查GAT1基因剔除小鼠對(duì)這些傷害性刺激引起的痛反應(yīng)是否發(fā)生變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)純合子基因剔除小鼠除了對(duì)福爾馬林注射引發(fā)的炎癥痛的第二時(shí)相無(wú)疼痛耐受外，對(duì)其他傷害性刺激都有明顯的耐受現(xiàn)象；基因剔除的雜合子也表現(xiàn)出對(duì)急性熱痛的不敏感。同時(shí)，GAT1專一性抑制劑(No-711和tiagabine，10mg/kg，i.p.)在雜合子和野生型小鼠上均可在上述四種模型上表現(xiàn)出

7、明顯的鎮(zhèn)痛作用，而對(duì)純合子則無(wú)效；在兩種急性熱痛測(cè)試中，嗎啡(5mg/kg，s.c.)對(duì)三種基因型都有顯著的鎮(zhèn)痛作用，且在甩尾測(cè)試中，嗎啡的鎮(zhèn)痛作用在純合子和雜合子上被顯著增強(qiáng)。此外，利用在三種不同水溫中強(qiáng)迫游泳(4、10和33℃)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生應(yīng)激以考查內(nèi)源性(阿片和非阿片依賴)的鎮(zhèn)痛作用是否發(fā)生改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜合子和純合子小鼠由應(yīng)激誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用比野生型顯著增強(qiáng)。GABA(B)受體激動(dòng)劑(baclofen，12.5mg/kg，i.p.

8、)誘導(dǎo)小鼠體溫降低實(shí)驗(yàn)說(shuō)明純合子的GABA(B)受體功能可能發(fā)生改變。這些結(jié)果表明，GAT1對(duì)于機(jī)體的疼痛反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，下調(diào)或利用GAT1抑制劑阻斷GAT1的功能可有效地減輕多種傷害性刺激引起的痛反應(yīng)，GAT1的抑制劑具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)也暗示長(zhǎng)期大劑量地使用GAT1抑制劑可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生耐受，從而失去對(duì)持續(xù)性疼痛的治療作用。
　　 第三部分、GAT1基因剔除對(duì)藥物成癮和認(rèn)知功能的影響
　　 已有的研究表

9、明GABA能系統(tǒng)在藥物成癮以及學(xué)習(xí)與記憶中起著重要的作用，而GAT1可通過對(duì)胞外GABA濃度的調(diào)節(jié)來(lái)影響藥物成癮和學(xué)習(xí)與記憶的過程。我們以前的研究顯示，過表達(dá)GAT1的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出認(rèn)知功能減退，且對(duì)嗎啡的獎(jiǎng)賞和生理依賴作用減弱。為了進(jìn)一步地研究GAT1在藥物獎(jiǎng)賞和依賴以及認(rèn)知中的作用，本文利用條件性位置偏好模型考查嗎啡和可卡因?qū)AT1基因剔除小鼠的獎(jiǎng)賞作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比：純合子對(duì)藥物的條件性位置偏好作用明顯減弱，說(shuō)明藥

10、物的獎(jiǎng)賞作用降低，而與此相反，雜合子表現(xiàn)出更強(qiáng)的藥物誘導(dǎo)的條件性位置偏好，說(shuō)明其對(duì)藥物獎(jiǎng)賞作用增強(qiáng)。在嗎啡成癮后的戒斷實(shí)驗(yàn)中，與野生型小鼠相比，純合子明顯減少戒斷癥狀中的跳躍反應(yīng)，而對(duì)其他戒斷癥狀則無(wú)差異，說(shuō)明純合子對(duì)嗎啡的依賴作用有一定的減弱。在兩種不同的記憶模型：空間記憶模型(Morris水迷宮)和暗箱回避模型(被動(dòng)回避)的測(cè)試中，與野生型小鼠相比，純合子小鼠表現(xiàn)出認(rèn)知能力的明顯下降，而雜合子小鼠表現(xiàn)出認(rèn)知能力的明顯增強(qiáng)。與行為變化