紅掌‘阿拉巴馬’低溫相關(guān)基因AOX、CAT和APX的表達(dá)分析、功能驗(yàn)證及遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、紅掌(Anthurium andraeanum)是天南星科花燭屬高檔室內(nèi)觀賞盆花，屬佛焰花序類植物。紅掌由于花型奇特、顏色鮮艷多彩而深受人們喜愛(ài)，是居家裝飾和饋贈(zèng)親友的最好選擇，在盆花市場(chǎng)特別是年宵花市場(chǎng)上占了很大比例，因此在浙江省的種植面積正在迅速擴(kuò)增。而且隨著人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)理念的轉(zhuǎn)變，對(duì)高檔盆花的需求越來(lái)越大，市場(chǎng)還有著巨大潛力。然而由于紅掌原產(chǎn)熱帶，對(duì)溫度較為敏感，生長(zhǎng)溫度要求15℃以上，低于12℃容易產(chǎn)生冷害，低溫

2、是限制紅掌生長(zhǎng)發(fā)育的重要逆境因子。在我省種植存在高能耗、高成本的問(wèn)題，降低了市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，影響了紅掌盆花產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康的發(fā)展。要解決這個(gè)問(wèn)題的最根本途徑就是采用育種手段從根本上提高紅掌的抗寒性，對(duì)于我省的花卉產(chǎn)業(yè)的做大做強(qiáng)則顯得十分必要和緊迫。本研究采用PCR結(jié)合RACE技術(shù)，以紅掌‘阿拉巴馬’為材料，從其葉片中克隆得到交替氧化酶AOX、過(guò)氧化氫酶CAT和抗壞血酸過(guò)氧化物酶APX3個(gè)基因全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR

3、技術(shù)分析各基因在紅掌不同組織器官和不同低溫脅迫下的表達(dá)情況;構(gòu)建了紅掌抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行功能驗(yàn)證;最后，將脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)化紅掌并獲得了抗性植株。取得的研究結(jié)果如下:
　　 1、紅掌交替氧化酶基因AnAOX全長(zhǎng)基因的克隆與序列分析
　　 從紅掌葉片中克隆與低溫脅迫相關(guān)的基因AOX,其全長(zhǎng)序列為1170 bp，命名為AnAOX（GenBank登錄號(hào):JX163297），該基因含有103

4、8 bp的開放閱讀框，編碼345個(gè)氨基酸，AnAOX編碼蛋白預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)(pI)為8.51，分子量大小約為38.0 kD。利用DNAMAN5.2.2軟件，分析AnAOX基因編碼的氨基酸序列，認(rèn)為該基因具有完整的3'和5'末端，是花燭屬紅掌交替氧化酶基因的全長(zhǎng)序列。紅掌AOX推測(cè)的氨基酸序列與馬鈴薯（Solanum tuberosum）、水芭蕉（Lysichiton camtschatcensis）、羽葉蔓綠絨(Philodendronb

5、ipinnatifidum)和腎葉臭菘（Symplocarpus renifolius）的AOX的同源性分別為82％、80％、78％和77％。所有的序列中都存在完全保守的鐵離子結(jié)合區(qū)域和組氨酸殘基，它們可能與AOX基因在植物中的功能密切相關(guān)。
　　 2、紅掌過(guò)氧化氫酶基因AnCAT基因的克隆與序列分析
　　 以紅掌‘阿拉巴馬’品種葉片提取的總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR與RACE擴(kuò)增，獲得一個(gè)1704 bp的過(guò)氧化氫酶

6、(Catalase，CAT)基因的cDNA序列，其基因編碼區(qū)共1476 bp，編碼492個(gè)氨基酸，命名為AnCAT(GenBank登錄號(hào):JX163298)。AnCAT編碼蛋白預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)(pI)為6.89，相對(duì)分子量約為57.1 kD。紅掌CAT推測(cè)的氨基酸序列與與馬蹄蓮（Zantedeschia aethiopica）、油棕（Elaeis guineensis）、小果野蕉（Musaacuminata）和秈稻(Oryza sativa

7、 Indica)的CAT的同源性分別為91％、87％、87％和81％。
　　 3、紅掌抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因AnAPX基因的克隆與序列分析
　　 以天南星科花燭屬紅掌‘阿拉巴馬’品種葉片提取的總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR與RACE擴(kuò)增，獲得一個(gè)888 bp的抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)基因的cDNA序列，其基因編碼區(qū)共750bp，編碼250個(gè)氨基酸，命名為AnAPX(GenB

8、ank登錄號(hào):JQ8385071)。根據(jù)Protparam在線軟件預(yù)測(cè)紅掌抗壞血酸過(guò)氧化物酶蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明推測(cè)APX蛋白的分子式為C1232H1904N330O363S7，相對(duì)分子量約為27.4kD，等電點(diǎn)(pI)為5.40;理論推導(dǎo)半衰期約30h，不穩(wěn)定參數(shù)為32.55，屬于穩(wěn)定蛋白。紅掌APX推測(cè)的氨基酸序列與馬蹄蓮（Zantedeschia aethiopica）、華東葡萄（Vitispseudoreticulata）、

9、棉花（Gossypium hirsutum）、油棕（Elaeis guineensis）和玉米（Zea mays）的APX的同源性分別為93％、87％、87％和86％。
　　 4、紅掌AnAOX、 AnCAT和AnAPX基因的表達(dá)分析
　　 通過(guò)定量PCR研究上述三個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)與紅掌葉片低溫脅迫之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，6℃處理后，紅掌葉片AnAOX、 AnCAT和AnAPX基因均上調(diào)表達(dá)。其中AnAOX基因在低溫處理1

10、2 h后上調(diào)表達(dá)不明顯，處理24 h后開始明顯上調(diào)表達(dá)，且處理24 h表達(dá)量顯著高于12 h;低溫處理超出24 h后，表達(dá)量略有下降，36～48 h之間表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。AnCAT基因在低溫處理12h后表達(dá)明顯上調(diào)，超過(guò)12h表達(dá)量開始下降，當(dāng)?shù)蜏靥幚頃r(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，表達(dá)量與對(duì)照接近甚至略低于對(duì)照;AnAPX基因在低溫處理12h明顯上調(diào)表達(dá)，且隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，上調(diào)表達(dá)逐漸上升，當(dāng)處理48 h后上調(diào)表達(dá)達(dá)到頂峰。由此推測(cè)，紅

11、掌AnAPX基因表達(dá)量的變化與低溫及低溫持續(xù)時(shí)間關(guān)系最密切，其次是AnAOX基因、AnCAT基因。
　　 5、紅掌AnAPX植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 根據(jù)AnAPX基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異引物，以紅掌‘阿拉巴馬’葉片為試材，得到AnAPX基因完整的開放閱讀框。將擴(kuò)增到的片段與pMD18-T載體連接并進(jìn)行序列測(cè)定，表明插入片段正確?？寺∑谓?jīng)雙酶切消化插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA2300中，構(gòu)建了AnAPX基因的表達(dá)載體。

12、在成功構(gòu)建AnAPX表達(dá)載體后，采用電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株中，為后續(xù)AnAPX功能驗(yàn)證莫定了基礎(chǔ)。
　　 6、紅掌基因轉(zhuǎn)化
　　 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以紅掌愈傷組織為侵染材料，將綠色熒光蛋白基因GFP和脂肪酸去飽和酶基因FAD3轉(zhuǎn)化紅掌，通過(guò)G418和卡那霉素篩選，獲得了轉(zhuǎn)基因紅掌植株。用PCR反應(yīng)對(duì)具卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因紅掌植株進(jìn)一步鑒定，結(jié)果表明目的基因FAD3已經(jīng)整合到部分轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，成功